重组腺相关病毒（rAAV）以低免疫原、非整合、广泛组织靶向性而成为有前景的动物实验手段及基因治疗平台。目前，AAV广泛用于小鼠、猴子等模式生物的转基因研究以及临床试验，包含阿尔茨海默氏病、关节炎、脂蛋白脂肪酶（LPL）缺乏、帕金森氏病、肌肉营养不良和恶性肿瘤等众多疾病^【1】。

 

但天然的rAAV基因组为单链DNA（ssDNA），必须依靠细胞复制因子来合成互补链，此步骤是rAAV载体表达效率及开始表达时间的限制因素^【2】。

 

经过ITR改造，自互补AAV（scAAV，即双链AAV）绕过了第二链合成的限速步骤，除了提升载体递送效率之外，还可增加体内外转基因表达的强度、缩短开始表达时间，以及具有更高的体内DNA稳定性和更有效的环化作用，低剂量scAAV即可实现高剂量ssAAV的表达效果，可以有效降低动物实验的成本，尤其是以猪、猴子等大型动物为研究对象的实验^【3】。

 

 

图1. ssAAV及scAAV结构图

 

 

在以下研究中，作者对比了单链ssAAV和双链scAAV在体内的表达情况。首先，构建了CMV驱动的促红细胞生成素基因（mEpo）ssAAV，以及对应的二聚体形式scAAV，分别注射2E+10病毒至小鼠门静脉，并以7天为间隔检测mEpo的表达，结果如图2所示：scAAV表达周期比ssAAV提前一周，且表达水平显著高于ssAAV^【4】。

 

图2. mEpo表达示意图

 

 

基于以上研究成果，吉凯基因研发人员开发出了scAAV载体，利用CMV-Luc报告系统检测，结果表明无论在细胞水平还是在体水平scAAV的转导效率更高、表达时间更快。具体结果如下：

 

1. 细胞水平

 

以相同剂量梯度的ssAAV和scAAV感染293T细胞，于72小时检测荧光素酶活性，结果如图3所示：scAAV转导效率较常规ssAAV提升1.5-2倍。

 

 

2. 动物水平

 

 

以ssAAV以及scAAV为载体将萤火虫荧光素酶报告系统递送至小鼠体内，通过尾静脉注射总量为1E+11的病毒并在多个时间点检测肝脏表达情况。结果如图5所示scAAV组荧光素酶表达显著快于ssAAV组，并且注射后相同时间点scAAV组荧光素酶表达水平显著高于ssAAV组。

 

图4. scAAV及ssAAV 在小鼠体内不同时间点表达效果检测

 

在基因治疗研究领域，病毒转染效率低、病毒滴度有限等问题制约着基因治疗的发展。而scAAV则有望克服以往难题，推动基因治疗领域的发展^【8、9】。目前已有相关研究表明scAAV用于基因治疗的可行性。小编以三篇文章为例简述：

 

 

一、青光眼的基因治疗


 

将单剂量的scAAV.GFP注射到大鼠和食蟹猴眼中。通过荧光，免疫组化和无创性淋巴镜检查来评估GFP的表达。直至注射后27天，在注射AAV的大鼠的前节组织上均未观察到GFP转导。相比之下，scAAV可以非常有效地转导小梁网，起效快（4天）。眼睛保持清澈，未观察到不良反应。如图5、6所示：转基因表达在大鼠中持续> 3.5个月，在猴子中持续> 2.35年^【5】。

 

图5. 大鼠眼部注射scAAV2.GFP后不同时间点GFP表达检测

 

图6. 猴子眼部注射scAAV2.GFP后不同时间点GFP表达检测

 

 

在大鼠和猴子的小梁网中scAAV病毒载体提供更长时间且安全的转导，因此其可被开发为小梁网药物用于青光眼的基因治疗。

 

二、角膜移植



 

角膜内皮细胞（CEC）在角膜后表面形成一个单层，与视力密切相关。他们的泵功能是角膜基质消融以维持角膜透明所必须的。因为其是单层细胞所以每个细胞都与培养基直接接触。而且其没有血管和免疫能力，降低了免疫反应的风险。此外在移植前其在体外培养一到四周，因此给予了开发基因治疗的可能。然而使用ssAAV需要极高的病毒滴度以保证基因的表达，而scAAV的出现有望解决这一难题。

 

该研究表明，在大多数情况下，scAAV载体仅需要一半用量即可达到与ssAAV相等或更高的基因表达率。在人类供体角膜中，同样用量的scAAV可达到感染并在64.7±11.3％的细胞中表达GFP，而SSAAV仅可在38.0±8.6％的细胞中表达（p <0.001）。此外，scAAV转导的细胞可保持活力并显示规则的形态^【6】。
 

 

图7. 不同滴度的ssAAV2和scAAV2感染HCEC12细胞两天后效果检测

 

三、递送含有结构的基因



 

研究发现scAAV更适合递送shRNA等含有结构的基因。如图8所示，研究人员发现使用ssAAV载体构建shRNA会产生较多的截短和有缺陷的AAV基因组，从而降低产量。而scAAV由于不存在第二链的合成，不受序列结构影响，从而实现高效稳定地表达^【7】。

 

图8. ssAAV、scAAV基因组复制模型及短发夹DNA截断示意图

 

scAAV递送如shRNA这样含有结构的遗传物质，可以有效降低截断型无效aav基因组，提升了病毒基因组稳定性及表达效率，为基因治疗提供了可靠的递送方式。经过大量测试，除在极化的气道上皮细胞与慢性淋巴细胞性白血病（B-CLL）细胞中scAAV载体转导效率较之ssAAV未有明显改善外，在啮齿类动物、犬类和非人类灵长类动物模型中，均发现scAAV的转导效率较之ssAAV显著提高^【8】。

 

综上，scAAV因其表达快、感染效率高、作用时间久且免疫原性低等特征，使得在使用ssAAV遇到问题时有了更有效的替代工具。尤其是在临床试验中，scAAV使得基因治疗前景更加光明。然而因为scAAV载体容量仅为ssAAV载体的一半，这一定程度上限制了scAAV的应用，不过我们相信随着技术的发展，科学家们终会开发出更加突破性的递送介质。