基因过表达 (overexpression,OE) 以及敲降 (KO、KD) 是研究基因功能的常用技术，敲降的手段多种多样，如化学合成 siRNA、载体构建 shRNA、针对基因组的基因敲除、针对 RNA 的 CRISPRi 等。但 OE 的手段很少，大部分科研工作者只了解构建外源过表达、CRISPR-SAM 两种，那么还有没有其他新颖的方式呢？

 

还真有！答案就是 saRNA（small activating RNA），saRNA 是由 21 个核苷酸组成的小分子非编码 RNA，其结构和化学成分与 siRNA 相同，但作用机制完全相反，是通过靶向基因启动子区域，引发染色质构象的改变或者改变组蛋白及 DNA 甲基化修饰水平，从而引发转录激活作用 ¹。

 

saRNA 的分子机制

 

saRNA 机制在机体中是广泛存在的，细胞主要依靠 miRNA、piRNA 实现激活途径，如 mir-373 靶向 E-cadherin 和 CSDC2 启动子的激活 ²、果蝇中 piRNA 触发的转录活性 ³。国内科研工作者早前以 p21-saRNA 向肿瘤细胞递送 p21-saRNA 评估抗肿瘤能力 ⁴（p21 基因下调是结直肠癌的标志之一），为后续治疗结直肠癌提供选项，效果如何呢？

 

作者以 p21-saRNA-322（322 对应启动子区域的相对位置，图 2）递送三种大肠癌细胞（HCT-116，HCT-116（p53 – / –）和 HT-29），通过 QPCR 以及 WB 检测了 p21 基因的表达（图 3），结果显示，saRNA-322 于 72h 显著提升了 p21 的表达水平。

 

p21-saRNA-322 靶点设计示意图

p21-saRNA-322 上调大肠癌细胞 p21 基因的 QCPR, WB 实验

 

后续，作者以流式分析确认了 p21-saRNA-322 大肠癌细胞在 G0 / G1 期细胞发生周期停滞（数据见原文），并同时在动物水平，验证了 p21-saRNA-322 对于肿瘤发生的抑制性：

 

裸鼠成瘤及瘤体检测

（持续五周的裸鼠实验数据，每 3 天瘤内注射 a 组 PBS，b 组 Scramble RNA，c 组 p21-saRNA-322；（A）裸鼠成瘤；（B）肿瘤提取；（C）对肿瘤的重量、体积测量；（E）肿瘤切片 p21 染色）

 

由此可见，p21-saRNA-322 在三种大肠癌细胞都实现了 p21 基因的上调，并在细胞与动物水平实现了表型的改变。需要指出的是，同个 saRNA 在不同细胞系，促进水平是有差异性的。在 PC-3，HeLa 和 MCF-7 细胞中，与 saCON 相比，p21-saRNA-322 对 RNA 诱导分别为 12.5 倍，10.1 倍和 2.4 倍。

 

p21-saRNA-322 对三种细胞的表达提升水平

 

p21-saRNA-322 在多种细胞实现靶基因的上调在 E-cadherin 基因上得到了重现 ⁵，显示出 saRNA 机制在细胞是普遍存在的，这为进一步的基因治疗开发提供了可能性。关键蛋白表达的下降通常是许多疾病的主要原因，恢复细胞中这些蛋白表达的新技术有待开发。目前主要手段有 mRNA、Crispr 激活、反义寡核苷酸和 saRNA。但是无法合成长片段的 mRNA、Crispr 受困于脱靶效应及递送方式，T7 体外转录的 RNA 可能产生异常的副产物，这些都限制了向基因治疗方向的运用。而 saRNA 由于其序列较短、生产成本低且可控等因素，有进一步开发为药物的优势，当然也需要克服免疫原性、脱靶性，以及合适的递送方式（纳米递送、脂质体、外泌体等）这些问题 ⁶。目前处于开发中的 saRNA 如下：

 

开发中的 saRNA

 

对于科研人员，saRNA 提供了除过表达、CRISPR-SAM 两种常用技术之外的第三种思路，尤其是针对大基因无法构建包装的情形。saRNA 可借助载体构建的策略，稳定构建于质粒及病毒载体中，以实现直接化学合成无法达到的长期高效地表达，且周期短、成本低。当然，saRNA 也有其弊端，如需要筛靶、只能激活细胞本底表型，无法表达突变型等。
 

 

不同的 OE 表达方式适合不同情形的实验，虽然各有优劣，但 saRNA 对于单基因下调引发的疾病治疗具有广阔的开发前景，吉凯基因可提供 saRNA 的一站式靶点设计、载体构建、病毒包装的服务，并长期注重于转化医学的新技术及工具开发、推广，还在等什么，感兴趣的快来咨询吧！！！

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【参考文献】

1. Developing small activating RNA as a therapeutic: current challenges and promises

2. MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences

3. An epigenetic activation role of Piwi and a Piwi-associated piRNA in Drosophila melanogaster

4. Specific up-regulation of p21 by a small active RNA sequence suppresses human colorectal cancer growth

5. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells

6. Developing small activating RNA as a therapeutic: current challenges and promises