在心血管疾病中，动脉粥样硬化导致冠心病的发生是其中致残率和致死率最高的疾病。虽然经皮冠状动脉腔内成形术、冠脉搭桥术等有效重塑血管的技术手段不断发展，可以实现有效的疏通阻塞的动脉，改善血供。但是，术后内膜增生引起的支架术后再狭窄以及再狭窄引起的支架内血栓形成，会导致急性心肌梗死等严重心血管事件的发生和反复的手术治疗，使得疗效不尽如人意。研究表明，血管内膜增生在支架术后再狭窄的发生发展中扮演着重要的角色，同时也是动脉粥样硬化、静脉移植，高血压等疾病的共同病理生理学基础。因此，深入了解血管新内膜形成的机制有助于发现新的有效靶点，进而开发更有效地靶向治疗，具有重要的临床意义。 

2020年11月19日广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心邓伟豪团队在《Circulation》（2019年影响因子23.603，5年影响因子 21.054）上在线发表了题为“Circular RNA CircMAP3K5 acts as a microRNA-22-3p sponge to promote resolution of intimal hyperplasia via TET2-mediated SMC differentiation（点击查看原文）”的文章，揭示了血管新内膜形成的关键机制。

邓伟豪教授团队成员合照

研究方法

该研究中作者利用CircRNA测序，在人冠状动脉平滑肌细胞中找到在去分化表型的VSMC中起关键作用的CircMAP3K5，并在细胞和动物水平证明了过表达CircMAP3K5可通过miR-22/TET2通路促进VSMC分化。揭示CircMAP3K5有望成为血管新内膜形成治疗的潜在新靶点。

 

首先在人原代冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）进行CircRNA-seq，PDGF处理组与对照组比较，发现CircMAP3K5在PDGF处理的HCASMC中表达明显降低（图1）。接着，在冠心病患者的冠状动脉中CircMAP3K5的表达与非冠心病患者相比显著减少（图1）。进一步验证CircMAP3K5的表达，分别给予PDGF促进VSMC去分化和RepSox促进VSMC分化，然后采用PCR检测CircMAP3K5的表达变化，结果表明CircMAP3K5在去分化VSMC中表达呈时间依赖性降低，而在RepSox处理的分化VSMC中表达呈时间依赖性升高（图1），该结果提示CircMAP3K5在VSMC中具有生物学功能。

 

图1. CircMAP3K5在血管平滑肌细胞中的表达模式

接着，我们在小鼠股动脉损伤模型中也证实了：CircMap3k5在内膜增生的股动脉中表达明显下调，而且其线性RNA并没有变化（图2）。在体模型中，作者利用吉凯基因的AAV产品（AAV9-CircMap3k5、AAV9-CON）在小鼠中过表达CircMap3k5（图2），股动脉损伤后静脉注射AAV9-CircMap3k5，在体水平实现高效特异的基因表达，可明显减少新内膜增生（图2）；

图2. 注射CircMap3k5可缓解小鼠血管内膜增生

 

在体外过表达CircMAP3K5可明显抑制HCASMC的增殖，促进HCASMC分化（图3）；

图3. CircMAP3K5抑制VSMC的增殖，促进其分化

采用Pulldown、生物信息学分析、萤光素酶报告基因和免疫荧光共定位等实验手段，证明CircMAP3K5通过作为miR-22的海锦体，通过调控下游靶基因的表达发挥对VSMC的功能调控作用（图4）；

 

图4. CircMAP3K5作为海锦体与miR-22相结合

小鼠股动脉损伤模型：miR-22 KO小鼠结果显示新生内膜较对照组明显减轻，miR-22下游靶基因Tet2的表达显著上调（图5）。作者利用吉凯基因的AAV产品（AAV9-CircMap3k5）在miR-22 KO小鼠中过表达CircMap3k5，股动脉损伤后静脉注射AAV9-CircMap3k5，在体水平实现高效特异的基因表达。由于miR-22被敲除，尽管过表达CircMap3k5，抑制新内膜增生的作用也没有增强（图5），miR-22下游靶基因Tet2的表达也没上调（图5）；

图5. CircMAP3K5通过与miR-22相结合发挥作用

同样，在SMC特异性敲除Tet2（SMC-Tet2 KO）小鼠结果显示新生内膜较对照组明显加重（图6）。作者利用吉凯基因的AAV产品（AAV9-CircMap3k5）在SMC-Tet2 KO小鼠中过表达CircMap3k5。由于Tet2在SMC中被敲除，尽管过表达CircMap3k5，其抑制新内膜增生的作用被消除（图6）。

图6. 在SMC中缺失Tet2 也可消除

CircMap3k5对内膜增生的保护作用

 

总 结

1. 在CircRNA测序中鉴定出的CircMAP3K5，在冠心病患者的冠状动脉中与非冠心病患者相比显著减少；

 

2. 股动脉损伤后静脉注射AAV9-CircMap3k5可明显减少新内膜增生；

 

3. CircMAP3K5作为竞争内源性RNA封闭miR-22-3p，miR-22-3p的缺失不能抑制TET2，从而维持VSMC的分化。

图7. CircMAP3K5调控平滑肌细胞表型转换的机制图

吉凯助力

该研究中CircMap3k5过表达腺相关病毒产品（AAV9-pCMV-CircMap3k5，AAV9-pCMV-empty）由吉凯基因提供。在体水平实现高效特异的基因表达调控。

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