2020年的岁末，吉凯基因针对老师们在科研中遇到的一些常见、基础、但又非常重要的问题进行年终总结。搬砖小陈抽丝剥茧，提取出十八个问题，以两期文章阐述，涉及过表达转录本选择、基因下调注意事项、荧光素酶实验、细胞感染、动物实验等多方面问题，希望能帮助老师们在前端设计时避免入坑。
 

基因过表达

// 一个基因的转录本那么多，我该如何选择进行构建呢？

在NCBI数据库，以人的为例，大部分基因含有的转录本不止一个（如TP53含15个，STAT1含14个），这还不算其他数据库的数据，少量基因能达到百余个转录本，为何转录本如此多产？

 

前体RNA在剪切的过程中，通过外显子的去除或者保留，产生不同序列的转录本，转录本的产生受到细胞类型、细胞状态，发育时间等因素的影响，也就是众多转录本在一种细胞中往往不会同时产生。少数转录本之间功能不同（如PKM基因的两个亚型M1和M2，在胚胎发育过程中，M2逐渐被M1所取代；在肿瘤发生过程中，M1下调而M2则再度表达， M2在癌细胞中发挥着独特的作用）。如果转录本编码区长度相近，大部分情况下功能是类似的，也就是可以替代使用的。

 

常规转录本的选择有三点建议：

1. 根据对应的参考文献选择。按照要做的功能，构建参考文献的转录本（大部分文献不会写转录本ID，可以根据蛋白大小、位点信息等确认转录本ID）；

 

2. 选择编码区较长的转录本构建，因为编码区越长，含有的结构域信息越多，功能也会越全；

 

3.查询蛋白数据库，里面收录常做的，规范型转录本，如下：

 

如果想要知道不同亚型之间的差异，可以在NCBI-GENE主页的“Genomic regions, transcripts, and products”图中查阅转录本之间的差异性，解读方式如下：

 

以NM_000546和为例NM_001276697，前者比后者N端多了三个外显子，编码区多了近159个氨基酸，再结合UNIPROT收录的结构域信息，就知道差异的氨基酸区段跟方框涉及的功能有差异：

 

要了解更多转录本选择标准，可见《So many transcripts，选择哪个做过表达研究呢？》。

 

//构建了质粒/病毒，转到细胞，发现WB验证无上调，是怎么回事？

 

蛋白水平表达效率不高，可从以下几点分析：

 

1. 质粒/病毒的转导效率是否高？质粒对于大部分细胞，转染效率较低，且随着细胞传代，会逐步丢失；而病毒感染效率也因细胞类型差异而不同，实际操作过程中，建议用载体自带的荧光或者抗性，将未转导进质粒/病毒的细胞去除，再进行检测；

 

2. 因实验需要，如果质粒/病毒未带荧光，而直接用药物筛选，需要确认药物浓度是否为最佳。在感染病毒前，应做药筛的预实验，摸索最佳药筛浓度，尽可能杀死空细胞。即便目的病毒未带荧光，也建议加一组既带荧光，也带抗性的对照病毒做预实验;

 

3. 很多细胞都有合适的启动子，如悬浮类用SFFV、干细胞优选EF1A、常规细胞或者肿瘤细胞可选CMV（无法表达于神经元）。老师们多喜欢用商业化载体做构建，如pcDNA3.1、pEGFP-N1等，因为文章好写，但不一定适合自己细胞的表达。吉凯基因将商业化载体改造，得到了比常规CMV启动子表达更强的启动子，解决了很多蛋白表达效率低的问题，由此可见，选择高表达的启动子很重要。
 

基因下调

// 做基因干扰，为什么文章被驳回了？

RNA干扰作为下调基因最常用的方式，人尽皆知，但当你觉得文章天衣无缝时，编辑的一句 “Need rescue mutation”或者“Need one more target siRNA”，你又得重新将实验再做一遍。

 

无论是siRNA，还是CRISPR/Cas9，都存在脱靶现象。以siRNA为例，设计靶点时，设计者会将siRNA靶点与现有核酸数据库中的非靶标序列碱基错配3个以上，以确保靶点不会靶向外源基因。但由于siRNA形成机制与miRNA高度类似，因此，siRNA可以潜在的以miRNA途径，即依靠7bp左右的序列结合非靶标基因，从而产生脱靶现象，而这一过程，blast是无法排除掉的。

 

因此，为了防止细胞功能变化是因为潜在的脱靶引发的，审稿人要求，要将靶基因做拯救实验---即将siRNA针对的基因做同义突变，再回输细胞进行过表达，看功能是否发生逆转，如果是，就说明功能与靶基因是关联的；当然，也可以用两条有效的siRNA做同步实验，由于两条siRNA序列不同，脱靶至同一基因的概率几乎为零，也能排除脱靶性。详情见《你的RNAi文章为什么被驳回？》。

 

// 非编码RNA为什么下调无效？

circRNA、lncRNA目前是研究热点，但siRNA下调这类分子普遍较难，主要有以下几大原因：

 

1.一部分非编码RNA定位细胞核，siRNA路径主要适用胞浆；

 

2.很多非编码分子表达水平较低，siRNA与靶基因结合是布朗运动随机碰撞结合表达量越低，敲减效率就越低

 

3.lncRNA含有较严重的二级结构，且多与蛋白结合，影响了siRNA的结合

 

4.circRNA多为外显子成环，可供设计靶点的区域只有30bp左右，能设计的siRNA及其有限

 

鉴于以上原因，相对于与mRNA难敲减情有可原。实际操作过程中，尽量多做些siRNA尝试，如果实在无效，只能采取CRISPR/Cas9将lncRNA从基因组上剔除，circRNA可以剔除内含子中促进成环的ALU序列，详情见《学会lncRNA沉默的方法，从此lncRNA研究不发愁！》。
 

荧光素梅

 

// 启动子为什么默认取2k，可以做长或者短点吗？

实际上，启动子分为两部分：

其一：核心启动子—即含有CAAT box与TATA box的基础转录活性单元，长约100bp，紧挨着转录起始位点（TSS），这段序列是实际上的启动子，构建时必须包含，但是转录活性很低。

 

其二：启动子调控区—由于核心启动子活性低，而基因表达调控是受启动子上下游的调控序列实现的，比如甲基化、转录因子调控、增强子调控等。我们说的研究启动子，实际上是研究调控区的位置，以转录因子为例，70%~80%的基因，调控区位于TSS上游2k以内，所以我们默认取2k构建。当然，一些基因的调控区位于远端（5k、10k、甚至更长都是可能的），或者内含子中，但如果没有CHIP等实验的验证，盲取是不可行的。如果实验验证转录因子与启动子有结合，但2k无结合，可以延长启动子构建，或者以chip实验分析具体结合区段，再进行双荧光素酶验证即可。

 

// 验证转录因子与启动子的结合，如何找出具体结合位点？

取启动子时，我们都会以转录因子预测网站如jaspar预测结合位点，并给出相应评分。如果只有少量位点，或者位点之间评分差异较大，则可以直接突变做验证；

 

但转录因子靠10bp左右的基序结合DNA，预测的结果往往较多，且评分相近，这种想一步到位做突变验证出阳性结合区域是不现实的。标准的做法是，构建启动子截断型、CHIP、EMSA，进一步确认结合区域。

小鼠Dcx启动子，截断证实活性区最短为249bp

 

再根据验证出的阳性结合区域中的结合位点，做突变验证即可：

249bp中的转录因子结合位点分别突变，

确认具体调控的转录因子

 

// 我要做的转录因子在数据库未收录，是什么情况，还能预测吗？

转录因子数据库有很多，目前使用频率较高的是Jaspar，该数据库严谨性高，非冗余，但也未收录所有转录因子的结合基序信息。此时，可以查询其他数据库有没收录；此外，很多蛋白有DNA结合能力，但本身不属于转录因子，此类在任何转录因子数据库都是不会收录的。

 

如果是非转录因子，或者转录因子数据库都未收录，此时可以查询文献，确认 结合DNA的特征，此法也适用于蛋白与RNA的结合，如下列HuR的motif，如果要做HuR与基因的结合，直接以基序兼并碱基的方式在靶基因序列里面搜索即可。

HuR蛋白结合RNA的motif

 

若motif也查询不到，那就只能自行研究了，可将蛋白结合的多个片段进行富集，进行同源性分析，找出共有碱基，具体方法参考文献《Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR》。

 

// miRNA与编码基因的结合，网站没有预测到结合，还能做吗？

targetscan、mirdb这些主流预测miRNA与编码基因结合的网站，都是基于种子区结合，也就是miRNA成熟体第二位碱基开始的连续6~8个碱基（hsa-miR-21-5p：

UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA），才计算结合可能性。实际上，种子区结合并不是绝对的，如果种子区有个别碱基的错配，或者miRNA全序列跟靶基因匹配度较高，则两者也是可能结合的，如TP53与mir-21的结合就不符合种子区结合特征，但实际是有结合的：

mirtarbase收录的人TP53与mir-21的结合

 

非种子区结合的可以借助rnahybrid这类网站分析，数据库具体使用方式见《视频教程∣做miRNA研究，miRNA靶基因预测会了吗？》

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