多巴胺(dopamine, DA)神经元在黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)的死亡是帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的一个病理性标志^[1,2]。PD的病理表现包括运动缺陷，运动迟缓和静息性震颤等，目前还没有减缓帕金森病的有效手段。其中α-Synuclein (α-Syn)和线粒体功能障碍是引起PD的已知诱因^[3-4]。

NLRP3炎症小体是先天免疫系统的主要组成部分，其是由细胞质模式识别受体NLRP3、衔接蛋白ASC和Caspase-1 (Casp1)组成的三蛋白复合体。致病性感染和无菌炎症都会触发该复合物的组装^[5]。其中NLRP3炎症小体需要“启动和激活”两个信号完成组装。启动过程中会形成NLRP3蛋白，激活过程中线粒体产生ROS，并在寡聚过程中形成接头蛋白ASC和蛋白酶Casp1^[4]。有研究表明，小胶质细胞NLRP3炎症小体过度激活导致无菌炎症反应有助于PD病理^[6]。但神经元炎症小体激活在神经退行性疾病中的作用尚不清楚。

近日，美国Johns Hopkins大学Ted M. Dawson实验室在Neuron发表了题为Neuronal NLRP3 is a parkin substrate that drives neurodegeneration in Parkinson’s disease的文章，阐明了抑制神经元中NLRP3炎症小体激活对PD治疗的有效性^[7]。

首先，研究者们将AAV GFP-Cre立体定向注射到成年parkinflx/flx小鼠的SNpc区（图1A），引起线粒体功能和质量下降，进而引起DA神经元死亡。通过免疫蛋白印迹分析发现，AAV GFP-Cre组小鼠脑内NLRP3和Casp1上调（图1B），这提示NLRP3炎症小体被激活。研究者们进一步通过免疫荧光染色的结果发现FLICA（标记ASC蛋白）和TH共标，这说明AAV GFP-Cre组炎症小体的激活发生在DA神经元内，而小胶质细胞中炎症小体激活并无差异。

图1: 敲除DA神经元parkin引起自身NLRP3炎症小体激活

 

为了进一步探究神经元NLRP3激活的作用，研究者们以Cre依赖的NLRP3基因突变小鼠：Nlrp3A350VneoR为实验对象（Cre存在时NLRP3基因会持续激活），分别向8-10周龄的Nlrp3A350VneoR小鼠SNpc区注射了AAV-GFP和AAV-GFP-Cre，并在三个月后对组织进行取材和组织学检查（图2A）。免疫组化的结果显示：SNpc区TH+神经NLRP明显激活，并且引起了炎症反应（图2B-D）。而且研究者们在注射AAV-GFP-Cre的一侧观察到了大量的DA神经元死亡（图2E-F）。这说明NLRP3炎症小体的激活会引起DA神经元死亡。

图2:NLRP3激活可引起DA神经元死亡

 

先前有研究表明在parkin缺失的情况下PARIS可抑制线粒体的形成进而引起线粒体缺失^[8-9]，由于线粒体功能异常会引起NLRP3炎症小体激活，研究者们接下来探究了PARIS在DA神经元炎症反应中的作用。研究者们分别将AAV shRNA-PARIS（或 AAV con-shRNA）与AAV GFP-Cre一起注射到成年parkinflx/flx小鼠的SNpc区，从而抑制敲低DA神经元的parkin后PARIS的反应（图3A）。研究结果显示，在敲除parkin后，敲低PARIS会抑制Casp1的上调，但NLRP3的水平不受影响（图3C），这提示PARIS可能参与了DA神经元NLRP3炎症小体激活的“激活”阶段但不参与“启动”阶段。

 

为了进一步确定NLRP3的作用，研究者们分别将AAV NLRP3-shRNA（或 AAV con-shRNA）和AAV GFP-Cre一起注射到成年parkinflx/flx小鼠的SNpc区从而抑制parkin敲除后NLRP3的反应。研究结果显示在敲除NLRP3后Casp1的激活完全消失了（图4A），并且AAV NLRP3-shRNA组DA神经元的数量相较于AAV con-shRNA组显著增加（图4B-C），这说明抑制NLRP3可避免parkin缺失时DA神经元的死亡。

研究者们也通过类似的方式探究了Casp1在parkin缺失时的作用。他们将parkinflx/flx小鼠分别和Casp1+/+小鼠以及Casp1-/-小鼠合笼，并向其后代成年小鼠的SNpc区定向注射AAV GFP和AAV GFP-Cre敲除parkin，并在三个月对小鼠进行组织学检测。研究结果显示敲除parkin缺失小鼠的Casp1同样可以避免DA神经元的死亡（图4D、E）。

 

图4:抑制NLRP3或Casp1都可避免parkin缺失小鼠DA神经元的死亡

 

此外，研究者们还对人类PD患者的脑组织进行了组织学检验，研究结果显示PD患者脑内NLRP3、Casp1、PARIS的水平都显著高于对照组（图5A）。并且研究者们在PD患者多巴胺神经元中观察到了明显的NLRP3和ASC水平上调（图5B、C、D），这进一步证实了在人类PD患者脑内的确存在DA神经元炎症小体激活的现象。

 

总之，这项工作阐明了DA神经元中NLRP3炎症小体激活导致DA神经元死亡的机制，并提出了抑制NLRP3和Casp1可避免DA神经元死亡的现象，也为PD治疗提供了一个新的疾病治疗靶点。

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参考文献…

[1] Dauer, W., and Przedborski, S. (2003). Parkinson’s disease. Neuron 39,889–909.

[2] Pirooznia, S.K., Rosenthal, L.S., Dawson, V.L., and Dawson, T.M. (2021). Parkinson disease: translating insights from molecular mechanisms to neuroprotection. Pharmacol. Rev. 73, 1204–1268.

[3] Di Maio, R., Barrett, P.J., Hoffman, E.K., Barrett, C.W., Zharikov, A., Borah, A.,Hu, X., McCoy, J., Chu, C.T., Burton, E.A., et al. (2016). a-Synuclein binds to TOM20 and inhibits mitochondrial protein import in Parkinson’s disease. Sci.Transl. Med. 8, 342ra378.