腺病毒（Ad）载体是最常用的癌症基因治疗载体，其中Ad5(adenovirus serotypes 5)型的载体被广泛用做基因递送载体。Ad 基因治疗显示出良好的抗肿瘤活性和免疫耐受性，因此，在临床试验中使用腺病毒的数量不断增加。

 

腺病毒的基本结构

一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb

衣壳呈规则的20面体结构，直径约80~110nm

衣壳含有240个六联体、12个五邻体及12根纤毛，还含有一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2。五邻体及纤毛的头节区可与细胞表面的受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。

 

 

腺病毒载体

市面上常见的腺病毒是基于AD5型腺病毒的基因组结构缺失E1区或者E1&E3区。E1区的缺失导致腺病毒载体不能复制，E1基因的缺失可在包装细胞HEK293（HEK 293细胞系表达E1蛋白）中得到补充。

 

选择适合的病毒载体

病毒载体的表达时间与实验观察时间是否相符

病毒载体可以容纳的片段大小与目的基因大小是否契合

病毒载体对目的细胞、在体组织的转导是否足够高效。

 

通常客户做体外细胞感染的话，大概率用慢病毒；如果要做稳转株，那就只能选慢病毒。

体内感染的话，大概率用AAV；

如果只是要短时间表达  那么可以尝试腺病毒；原代细胞、新生鼠、体内瘤体感染的话，大概率用腺病毒。

 

腺病毒作为基因递送载体

优势：

A 宿主范围广, 对人致病性低

腺病毒能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒载体系统可广泛感染一系列哺乳动物细胞，也是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。

B 能有效进行增殖，滴度高

腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1012~13VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。

C 不整合到染色体中，无插入致突变性

逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因，适合基因瞬时表达。

而在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。

D 能在悬浮培养液中扩增

腺病毒易于扩增，而其他病毒比如慢病毒和腺相关病毒需要重新包装。293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。

E 能同时表达多个基因

可以将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。

 

劣势：

a. 不能长期表达；

b. 高免疫原性，特别是在高剂量的情况下可能带来严重的毒性反应；

正是由于具有以上优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。

 

腺病毒常见问题解惑

腺病毒感染后检测时间

检测时间-体外细胞：腺病毒可在感染后48h检测；检测时间-体内细胞：腺病毒一般在病毒注射后2~4天检测；

 

荧光会在细胞持续多久

慢病毒荧光不随着细胞分裂传代而丢失；

腺病毒感染细胞后，在大部分细胞中，腺病毒可维持 7-14 天的表达时间；

AAV主要用于动物实验，荧光可维持大概3~6个月以上

 

关于抗性

腺病毒一般没有带抗性的载体，因为腺病毒表达时间短，一般不能用于抗性筛选。

 

E1、E3基因

腺病毒常规都没有保留E1、E3；E1为与复制能力相关的基因，E3为与致病性相关的基因。

溶瘤腺病毒保留了E3，E3区是在辅助质粒上，E3区的删除不影响病毒的复制，E3跟毒性有关。

 

为什么肿瘤适合用腺病毒

腺病毒具有嗜上皮细胞性，而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。

 

病毒于肿瘤细胞的选择性复制

通过特异性的肿瘤组织启动子来控制病毒增殖必需基因的表达来获得。将肿瘤组织特异性启动子（TSP）取代E1A基因自身的启动子，使其只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞内处于低表达或者不表达。

 

肿瘤特异性启动子分类

广谱性肿瘤特异性的启动子：在所有的肿瘤细胞中表达，如survivin 启动子、环氧化酶(COX-2) 启动子、hTERT 启动子。

针对特定肿瘤的启动子：仅在特定肿瘤细胞表达，如：前列腺特异性抗原（PSA）启动子，甲胎蛋白（AFP）肝癌启动子，癌胚抗原（CEA）上皮癌启动子。

 

动物实验病毒注射

病毒注射方式是一样的，如果是非分裂的细胞，腺病毒需要每隔七天注射一次；慢病毒是整合型的，一次注射长期表达；aav是伴随性病毒，只需要注射一次，可能长期表达。

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2. 病毒滴度≥1E+10 PFU/ml；

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