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精准医学趋势下如何使用珍贵的临床样本从蛋白质水平进行转化医学研究？
人阅读 发布时间：2018-10-31 14:39
一、前言
精准医学旨在针对每位患者的个体差异来调整疾病的预防和治疗方法，实现这一目标需要实现精准诊断作为前提。人体在分子水平（蛋白质，RNA，DNA，代谢中间产物）的变化含有大量潜在的诊断信息和治疗靶标，通过组学（比如蛋白组，基因组，代谢组）的方式采集更多的分子证据，可以基于不同分子证据的综合反映来对疾病进行更加精准的判断和治疗。未来从单一生物标记物过度到多重生物标记物（即分子特征），预期可以显著提高诊断的准确性；多种靶向药物的联合治疗也会越来越常见。比如早期诊断，对疾病实现精准的早期诊断将大大的提高疾病的治愈率，提高病人的生活质量，有效降低社会医疗负担。除了早期诊断，生物标志物还可以为医生提供更多可操作的信息，比如实现基于 Biomarker 证据的最佳治疗方案选择（预测性生物标志物）和疾病进展监测的预后判断（预后生物标志物）。问题是临床样本中包含丰富的信息，我们如何发现这些信息并和临床疾病联系起来？如何选择有效的技术手段进行筛选？
为了更好的筛选 Biomarker 和治疗靶标，研究开始需要提出定义明确的临床科学问题，比如区分患病和健康人群，比如更加细致的区分疾病发生发展或治疗的某一具体阶段。
二、研究案例思路分析
在临床问题的解决上，大规模的临床样本应用筛选时必经的过程，样本量通常随着研究要求的证据充分性的要求而不断增加。下面我们以国际同行认可的发表在高分学术期刊上的 2 篇文章来分析如何使用珍贵的临床样本从蛋白水平进行研究思路，解析主要包含 4 个方面：
案例1（心血管病领域），影响因子 18 分（文献及图片来源：Circulation. 2018;137:2741–2756. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.034365）
在分子水平，动脉粥样硬化被认为是细胞内外数百种蛋白质综合作用改变细胞的生物学过程和血管局部环境而形成的病理特征。无法通过早期动脉粥样硬化的诊断来实施个体化治疗严重阻碍了冠心病的防治。为了改善早期疾病检测，在临床症状发生之前延缓或中断疾病进程，很有必要认识动脉蛋白质网络的动态变化和特征模式。全面了解动脉蛋白质网络及其在早期动脉粥样硬化中的变化，可以筛选到新的生物标志物用于疾病检测和更优的靶标用于治疗。
死亡 24 小时内的 100 对尸检样本，腹主动脉（AA）和左前降支（LAD）冠状动脉各 1 g 组织。由病理学家对 10 毫米长的远端腹主动脉（AA）和 5 毫米长的 LAD 冠状动脉内膜表面进行如下动脉粥样硬化特征分级：（1）脂肪条纹（FS）; （2）纤维斑块（FPs）; （3）复杂病变; （4）钙化病变；随后进行蛋白质组学分析。
Label-free 蛋白质组学初步筛选鉴定
灵敏度和精度更高的 DIA（Data independent acquisition也称为SWATH）进行定量验证。分别比较 LAD 和 AA 的 FP（纤维斑块） vs NL（正常） 样本蛋白量的变化。样本数量 LAD (FP n=15; NL n=30) 和 AA (FP n=9; NL n=18)
案例2 （肿瘤领域）影响因子 13 分（文献及图片来源：NATURE COMMUNICATIONS | (2018) 9:1012 | DOI: 10.1038/s41467-018-03121-2 |www.nature.com/naturecommunications）
1. 提出明确科学问题
胃癌是世界上第三大致死性肿瘤，尤其是在东亚。Diffuse-type gastric cancer (DGC) 大约占肺癌中的 30%，预后差，基本没有靶向治疗的选择。虽然此前的研究通过基因组测序或者转录组分研究，对胃癌分成了不同的亚型，但是此前一系列的研究表明，mRNA 转录本丰度不能可靠地预测蛋白质丰度差异，尽管 CNV 对 mRNA 丰度表现出强烈的顺式和反式影响，但这些差异相对较少延伸至蛋白质水平。因此来自同一患者的配对肿瘤和癌旁组织，通过蛋白组学的筛选以发现蛋白质水平的改变对于 DGC 的诊断和治疗就非常重要。
4. 研究结果
通过定量蛋白组学获得的蛋白表达水平的变化可将弥散性胃癌（DGC） 分成 3 中亚型 (PX1，PX2，PX3)，每一种亚型具有不同的预后，每一种亚型的变化显著的信号通路也不相同。
三、案例总结
结合以上案例，我们发现研究者提出了明确的临床科学问题，针对所关心的科学问题，都设计了 100-200 例的临床样本进行筛选，采用蛋白组学的技术【DIA 技术，也有深度 label free（高成本）技术】进行，最终结果能对疾病进行分类分型，筛选获得 biomarker 或治疗靶标。不仅仅局限在心血管和肿瘤领域，在其他比如阿尔茨海默等神经系统疾病也开始有研究涉足。
四、 类似研究采用 DIA 蛋白组学技术为什么是更优的选择？
DIA（data-independent acquisition）蛋白组技术是新一代的蛋白组定量分析筛选检测技术，结合了 DDA（data-dependent acquisition）蛋白组定量广度和靶向蛋白组 SRM 定量精度的优势，能够用于大量生物样本的筛选检测，可重复性更高。DIA 蛋白组技术在 2015 年也被 Nature Methods 杂志评为前景非常看好的研究技术。
2. DIA 在一级质谱和二级质谱同时定量，所以蛋白定量更加准确。（文献来源：Technical advances in proteomics: new developments in data-independent acquisition. F1000Res, 2016. 5.）
3. DIA 技术的可重复性更高，可对大量生物样本进行检测；数据记录更加完整，可二次挖掘（文献来源：Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.）
4. DIA 蛋白组学技术进行大量样本数据采集分析时，单位成本更低。但同时对实验平台整体的质谱仪器硬件设备和分析软件的要求提高。
目前大量临床样本进行蛋白水平的分析在研究上属于未充分探索的领域，也会越来越成为一种研究趋势，所以DIA蛋白组学技术的出现和成熟使大多数实验室从技术和成本上实现该类型的研究成为可能。
凯基因已建立了完善的蛋白质组学技术平台，针对各种临床和生物研究样本，建立了高效可靠的蛋白质组学筛选研究方法和技术体系。2018年吉凯基因与科学服务领域的赛默飞世尔科技签署战略合作协议。共同建立了前沿的蛋白质组和代谢组学研究方法手段，以帮助科学家系统性解决蛋白组研究领域所遇到的复杂问题进行深度研发。
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精准医学旨在针对每位患者的个体差异来调整疾病的预防和治疗方法，实现这一目标需要实现精准诊断作为前提。人体在分子水平（蛋白质，RNA，DNA，代谢中间产物）的变化含有大量潜在的诊断信息和治疗靶标，通过组学（比如蛋白组，基因组，代谢组）的方式采集更多的分子证据，可以基于不同分子证据的综合反映来对疾病进行更加精准的判断和治疗。未来从单一生物标记物过度到多重生物标记物（即分子特征），预期可以显著提高诊断的准确性；多种靶向药物的联合治疗也会越来越常见。比如早期诊断，对疾病实现精准的早期诊断将大大的提高疾病的治愈率，提高病人的生活质量，有效降低社会医疗负担。除了早期诊断，生物标志物还可以为医生提供更多可操作的信息，比如实现基于 Biomarker 证据的最佳治疗方案选择（预测性生物标志物）和疾病进展监测的预后判断（预后生物标志物）。问题是临床样本中包含丰富的信息，我们如何发现这些信息并和临床疾病联系起来？如何选择有效的技术手段进行筛选？
为了更好的筛选 Biomarker 和治疗靶标，研究开始需要提出定义明确的临床科学问题，比如区分患病和健康人群，比如更加细致的区分疾病发生发展或治疗的某一具体阶段。
二、研究案例思路分析
在临床问题的解决上，大规模的临床样本应用筛选时必经的过程，样本量通常随着研究要求的证据充分性的要求而不断增加。下面我们以国际同行认可的发表在高分学术期刊上的 2 篇文章来分析如何使用珍贵的临床样本从蛋白水平进行研究思路，解析主要包含 4 个方面：
- 提出的明确科学问题
- 针对科学问题如何选择样本
- 采用的技术手段
- 研究结果
案例1（心血管病领域），影响因子 18 分（文献及图片来源：Circulation. 2018;137:2741–2756. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.034365）
1. 提出明确科学问题
在分子水平，动脉粥样硬化被认为是细胞内外数百种蛋白质综合作用改变细胞的生物学过程和血管局部环境而形成的病理特征。无法通过早期动脉粥样硬化的诊断来实施个体化治疗严重阻碍了冠心病的防治。为了改善早期疾病检测，在临床症状发生之前延缓或中断疾病进程，很有必要认识动脉蛋白质网络的动态变化和特征模式。全面了解动脉蛋白质网络及其在早期动脉粥样硬化中的变化，可以筛选到新的生物标志物用于疾病检测和更优的靶标用于治疗。
2. 针对科学问题如何选择样本
死亡 24 小时内的 100 对尸检样本，腹主动脉（AA）和左前降支（LAD）冠状动脉各 1 g 组织。由病理学家对 10 毫米长的远端腹主动脉（AA）和 5 毫米长的 LAD 冠状动脉内膜表面进行如下动脉粥样硬化特征分级：（1）脂肪条纹（FS）; （2）纤维斑块（FPs）; （3）复杂病变; （4）钙化病变；随后进行蛋白质组学分析。
3. 采用的技术手段
Label-free 蛋白质组学初步筛选鉴定
灵敏度和精度更高的 DIA（Data independent acquisition也称为SWATH）进行定量验证。分别比较 LAD 和 AA 的 FP（纤维斑块） vs NL（正常） 样本蛋白量的变化。样本数量 LAD (FP n=15; NL n=30) 和 AA (FP n=9; NL n=18)
4. 研究结果
通过血管组织进行蛋白组学筛选后，将有分泌潜能的差异蛋白在血清样本中进行检测。比较了 45 名患有血管造影证实的冠状动脉粥样硬化（病例）的女性和 41 名无冠状动脉疾病体征相似年龄女性（对照组）的空腹血清蛋白水平，发现 15 个血清蛋白构成的 panel 能够很好的预测早期动脉粥样硬化，AUC=0.93，CI=95%。
案例2 （肿瘤领域）影响因子 13 分（文献及图片来源：NATURE COMMUNICATIONS | (2018) 9:1012 | DOI: 10.1038/s41467-018-03121-2 |www.nature.com/naturecommunications）
1. 提出明确科学问题
2. 针对科学问题如何选择样本
168 个弥散性胃癌成对样本 (84 对癌 vs 癌旁)
3. 采用的技术手段
Label free 深度蛋白组学，每个样本分成 6 级，每级样本 75 分钟质谱时间（一个样本总质谱时间 7.5 小时）。
4. 研究结果
三、案例总结
结合以上案例，我们发现研究者提出了明确的临床科学问题，针对所关心的科学问题，都设计了 100-200 例的临床样本进行筛选，采用蛋白组学的技术【DIA 技术，也有深度 label free（高成本）技术】进行，最终结果能对疾病进行分类分型，筛选获得 biomarker 或治疗靶标。不仅仅局限在心血管和肿瘤领域，在其他比如阿尔茨海默等神经系统疾病也开始有研究涉足。
四、 类似研究采用 DIA 蛋白组学技术为什么是更优的选择？
DIA（data-independent acquisition）蛋白组技术是新一代的蛋白组定量分析筛选检测技术，结合了 DDA（data-dependent acquisition）蛋白组定量广度和靶向蛋白组 SRM 定量精度的优势，能够用于大量生物样本的筛选检测，可重复性更高。DIA 蛋白组技术在 2015 年也被 Nature Methods 杂志评为前景非常看好的研究技术。
1. DIA 分析确定的荷质比（m / z）窗口内的所有肽段信息，所以 DIA 不会损失肽段信号，采集更加完整。（文献来源：Technical advances in proteomics: new developments in data-independent acquisition. F1000Res, 2016. 5.）
2. DIA 在一级质谱和二级质谱同时定量，所以蛋白定量更加准确。（文献来源：Technical advances in proteomics: new developments in data-independent acquisition. F1000Res, 2016. 5.）
3. DIA 技术的可重复性更高，可对大量生物样本进行检测；数据记录更加完整，可二次挖掘（文献来源：Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.）
4. DIA 蛋白组学技术进行大量样本数据采集分析时，单位成本更低。但同时对实验平台整体的质谱仪器硬件设备和分析软件的要求提高。
目前大量临床样本进行蛋白水平的分析在研究上属于未充分探索的领域，也会越来越成为一种研究趋势，所以DIA蛋白组学技术的出现和成熟使大多数实验室从技术和成本上实现该类型的研究成为可能。
凯基因已建立了完善的蛋白质组学技术平台，针对各种临床和生物研究样本，建立了高效可靠的蛋白质组学筛选研究方法和技术体系。2018年吉凯基因与科学服务领域的赛默飞世尔科技签署战略合作协议。共同建立了前沿的蛋白质组和代谢组学研究方法手段，以帮助科学家系统性解决蛋白组研究领域所遇到的复杂问题进行深度研发。
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