教你怎么做miRNA靶基因验证（Q&A篇）

教你怎么做miRNA靶基因验证（Q&A篇）

同是实验室沦落人，我们也会在实验中遇到各种问题，作为好同志，我们一边失败着一边总结着，痛并快乐着。为了让帮助各位同学再也不需要经历我们所走的弯路，下面就总结一些荧光素酶实验中常见的问题，记得关注哦：

可以从以下几个方面来考察实验结果的客观性：

• 对照的2个实验组，即实验组1与实验组2 luc表达情况应无显著差异；

• 转染正常，质粒或mimic确保成功转染入细胞；

• luc检测值在仪器检测线性范围内。

共转染的几个质粒中，3' UTR质粒及Renilla质粒可通过最终的luc读值判断是否转染成功，而miRNA质粒或mimic的转染情况无法从最终的luc读值做出判断，因而针对miRNA，转染是否成功可用以下方法进行：

i.如转入的miRNA带荧光标记如GFP，则可直接在转染后、细胞裂解前，显微镜下观察细胞荧光；

ii.如转入的miRNA不带任何荧光标记，可考虑进行miRNA的qRT-PCR检测，通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组miRNA有显著过表达。

iii.设置一个荧光质粒转染参照组，同批转染一个组的细胞，间接反映出同批次实验的转染情况。

在确保实验体系无异常的前提下，如果最终检测到的结果是阴性结果，则基本可以判断目的miRNA不能直接调控靶基因的表达，不死心的话就再做一次，如果仍然是阴性结果，死心吧。

有的同学说我一次做出阳性结果一次做出阴性结果咋办？那就恭喜你再重复吧，结果一直波动的话可能是实验系统或其他原因，

实验中，我们往往会遇到无法重复出文献中结果的问题，这是肯定的，不同实验室实验条件、实验材料、实验细节并不能确保与文献完全一致所致。因此，只要我们相信自己就行。

该实验的关键点在细胞状态和转染效率，转染效率的优化可通过调整共转染质粒的比例或调整转染体系来进行，设置合理的质粒转染量梯度，观察microRNA对靶基因的抑制是否存在剂量效应或是否存在变化趋势的一致性，从而使结论更加可靠。

验证miRNA对靶基因的调控，也可直接检测miRNA过表达或下调表达后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的变化（Western Blot方法）。

有的同学喜欢使用mimics来做实验，其实mimics就是体外合成的成熟体miRNA，同样可以反转录，用qRT-PCR来检测表达量，但是大家应该很少看到有文章把mimics的过表达量PCR结果放出来的吧，那是因为mimics的过表达通常在数万到数十万倍，miIRNA通常会靶向结合许多靶基因，这么强的外源过表达肯定会引起严重的脱靶效应，给审稿人把柄质疑你吗？对于这种找抽的行为大家肯定是积极规避的。质粒介导的miRNA过表达由于是模拟了前体在生物体内的剪切，其过表达通常在数十倍到数百倍，可能引起的脱靶效应远没有mimics严重。