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利用AAV,让你的心血管系统研究起飞

发布时间:2021-02-19 10:28 |  点击次数:

利用AAV,让你的心血管系统研究起飞

 

心血管疾病的研究千千万万,我们如何利用心脏特异性的转基因鼠,和心肌细胞特异性的AAV病毒发个好文章呢?来来来,跟着小编一起看!
 

2017年5月16日,在心血管系统著名杂志《Circulation Research》上在线发表了北京大学分子医学所何爱彬研究组题为“Divergent requirements for EZH1 in heart development versus regeneration”的研究成果。研究揭示了表观调控因子EZH1在心脏发育和再生过程中,通过产生不同的组蛋白修饰,导致截然不同的分子机制,调控发育与再生两个关联的生物学过程,但是最终却殊途同归—促进心脏形态与功能的重建与完善。该结果为心脏再生的临床治疗策略提供了新的理论依据。

 

我们知道,由于成体心肌细胞(CM,cardiomyocyte)在损伤后缺乏有效的再生和自我修复能力,因此如何在心梗等心脏损伤性疾病后,修复和再生心肌细胞就成了极为棘手的医学问题。

PRC2 (Ploycomb Repressive Complex2) 是一个重要的表观遗传修饰酶复合体,它包括两个互补的催化亚基EZH1和EZH2,能修饰H3K27me3(抑制性组蛋白修饰)的形成从而抑制基因表达,但是其具体的分子机制尚不十分清楚。课题组前期发表的工作表明PRC2在心脏发育过程中起重要表观调控作用,下面利用心肌特异性基因敲除鼠、腺相关病毒AAV以及RNA-seq的方法,对PRC2的两个互补的催化亚基EZH1和EZH2的分子机制进行进一步探究。

首先通过构建EZH1和EZH2的敲除鼠,发现在早期心脏发育过程中,EZH1和EZH2均通过修饰H3K27me3的形成来抑制异位基因的表达,以一种互补的方式调控心脏发育。而EZH1和EZH2基因的同时缺失,会使小鼠的心脏发育发生紊乱。


图1 同时敲除Ezh1和Ezh2基因,会使小鼠的心脏发育过程紊乱


刚才研究的是心脏的发育,但是在心脏发生心梗后,心肌细胞再生的过程中,又是由哪一个亚基起作用呢?文章构建了EZH1、EZH2的敲除鼠,结果发现敲除EZH2基因的小鼠的心肌损伤程度以及心功能并没有显著性差异,而敲除EZH2基因的小鼠心脏损伤及心功能均有差异,这说明了心梗后心肌损伤的修复是由EZH1基因发挥着必不可少的调控作用。


  图2 对Ezh1和Ezh2基因进行敲除,发现Ezh1基因对于心肌细胞的再生是必须的

下面又进一步在敲除Ezh1基因的小鼠上,利用AAV为载体过表达EZH1基因,观察EZH1基因的回复实验。结果显示EZH1基因在心梗后心肌细胞再生中发挥重要作用,并且可以改善心脏疾病(心肌梗塞)后心脏的重建与功能。

图3 在Ezh1敲除鼠上,利用AAV为载体,过表达Ezh1,做回复实验
 

为了进一步研究EZH1基因的深入机制,作者又在野生型小鼠上,通过AAV为载体过表达EZH1、EZH2基因,并进一步评价了过表达该基因后,心梗小鼠的心肌纤维化面积及心功能。在这个过程中,又利用ChIP-seq的方法,进一步发现EZH1 是通过促进形成转录激活相关的组蛋白修饰(H3K27me1和H3K4me3)而激活心脏发育相关基因的表达,调控心肌细胞的增殖,促进心脏再生,从而改善受损心脏功能

  图4 在野生型心梗小鼠上,利用AAV为载体,过表达Ezh1,并深入探究其分子机制
 

该研究成果表明同一表观调控因子,可以通过产生不同的组蛋白修饰密码,导致截然不同的分子效应,最终却殊途同归—促进心脏形态与功能的重建与完善。

 

文章解析完了,那么慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)等都是常用的病毒载体,在心血管系统的研究中我们又该如何选择呢?

腺病毒:许多心血管疾病的研究会使用腺病毒载体进行,因为腺病毒对心肌细胞的感染效果较好,并且靶基因的表达效果较好。但是其表达是瞬时的(一般在心肌细胞中可持续1~4周),并且会引起较强烈的免疫反应,导致实验动物死亡。


图5. 利用腺病毒载体过表达CXCR7 基因
 

慢病毒:慢病毒的优点是可以将靶基因整合入宿主的基因组中持续稳定的表达,引起的免疫反应较为温和。但是其缺点是其对心血管系统的细胞(特别是心肌细胞)缺乏特异性的趋向性,实验者往往需要通过心肌组织注射的方法来实现心肌细胞的转染,而开胸实验的难度大,动物致死率高,因此影响其广泛应用。



图6. 利用慢病毒载体过表达ORP4L基因
 

腺相关病毒(AAV):与腺病毒相比,AAV具有更高的病毒转染效率并且AAV不需要与宿主的基因组整合,就能够稳定持续的表达,运用AAV为载体的一个显著优点是有些AAV血清型对于心肌细胞具有趋向性,因此现有的Ⅱ期临床试验,均使用AAV其中AAV1、AAV6、AAV8和AAV9对骨骼肌和心肌的趋向性最高。


 

图7. 利用腺相关病毒载体AAV过表达Ezh1、Ezh2基因


这里总结一下,如果各位老师想要利用病毒做小鼠的在体实验,建议选择AAV病毒,它具有滴度高,免疫原性低,并且1、6、8、9等血清型,对心脏都有较好的亲和性,就可以不用通过复杂危险的开胸实验,直接通过尾静脉注射感染心脏组织。


吉凯基因还为您准备了口碑好、高质量的AAV工具产品,血清型包括1、2、5、7、8、9、DJ、DJ/8、PHP.eB-301、PHP.B-301、PHP.S-301、Retro等常规、跨血脑屏障以及逆行标记类型,研究领域涉及心、肝、肺、胰、肌肉、神经、眼科学等各个领域。同时,我们于2015年在国内率先建立了cGMP级病毒生产车间,可提供临床级别的基因治疗载体病毒,旨在为基因治疗贡献一份力量!



另外,关于心血管系统病毒注射可以参考这篇文章

干货 心血管系统工具病毒注射方法与应用