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载体设计策略:腺病毒用于基因治疗

发布时间:2019-10-15 13:10 |  点击次数:

腺病毒(Ad)载体是最常用的癌症基因治疗载体。Ad 基因治疗显示出良好的抗肿瘤活性和免疫耐受性,因此,使用腺病毒的临床试验数量不断增加。

 

截至目前,已有大约 57 种人体血清型被鉴定出来,分为 7 种(从 A 到 G)。在适用的血清型中,物种 Ad5 是实验和临床环境中最常用的腺病毒, 目前已经证明 Ad5 主要与柯萨奇—腺病毒受体(CAR)结合。然而,当CAR 在癌细胞中的表达水平较低时,制约了 Ad5 介导的癌症疗法的效率。相比之下,腺病毒35型(Ad35)通过受体CD46感染细胞,而且CD46在癌细胞中大量表达。同时已经产生的含有Ad35纤维基因的嵌合载体Ad5/35或者Ad35载体,显示出较强的病毒感染性,改善了基因转导和抗肿瘤作用。

 

因而,已经有学者构建Ad5/35嵌合型的溶瘤腺病毒以提高传统Ad5型腺病毒的感染效率,并且有研究已经证实AD5/35嵌合病毒在低表达CAR的肾脏细胞中有具有很好的溶瘤效果。

我们今天要介绍的文章“Targeting CD46 Enhances Anti-Tumoral Activity of Adenovirus Type 5 for Bladder Cancer”,主要就分析了CD46靶向腺病毒疗法优于CAR以及Ad5/35的嵌合载体优于Ad5,首要目的是比较Ad5介导的CAR受体和嵌合病毒Ad5/35介导的CD46受体在膀胱癌肿瘤中的溶瘤效果观察。

 

研究主要分为三部分阐述:第一部分,文章详细阐明CAR和CD46在膀胱癌组织中的表达以及与膀胱癌患者临床特征的相关性;第二部分,体外实验分析Ad5-CAR和Ad5/35-CD46的溶瘤效果观察;第三部分,体内实验分析AD5-CAR和AD5/35-CD46的溶瘤效果观察。

 

一、CAR和CD46在膀胱癌组织中的表达以及与膀胱癌患者临床特征的相关性

作者收集了59个病例,而后做CAR和CD46的免疫组化分析,并根据CAR和CD46的表达水平,分析其与临床特征的相关性。

 

结果显示:CAR和CD46在膀胱癌组织中表达均增加。CAR与膀胱癌患者疾病的基本进程不相关;CD46在低tumor stage和低tumor grade中表达增加,且在高tumor stage和高tumor grade中表达减少;且CD46的表达越高预后较好,表达越低预后越差(如下图)。

 

这部分的临床意义表明,越早靶向CD46越有利于早期治愈膀胱癌。

 

二、CAR和CD46分别促进Ad5和Ad5/35腺病毒转导效果

为了验证CAR和CD46能过促进Ad5和Ad5/35腺病毒转导效果 ,本实验选取了同时低内源性表达的CAR和CD46的细胞,BHK(baby hamster kindey)细胞系,并且构建过表达CAR和CD46的稳定细胞株。

 

为了进一步检测2种腺病毒的转染效率,分别构建了Ad5-GFP绿色荧光标记蛋白和Ad5/35-GFP绿色荧光标记蛋白,在不同浓度的腺病毒转染24h后采用流式细胞仪分析GFP荧光蛋白在细胞中的百分比(如下图)。

基因调节的细胞毒性免疫疗法(Gene-mediated cytotoxic immunotherapy ,GMCI)是通过腺病毒(ADV)介导的单纯性疱疹病毒胸苷激酶(ADV-TK)瘤内注射,然后使用系统的抗疱疹药物,如伐昔洛韦或更昔洛韦(GCV),结合标准的肿瘤切除手术或放疗,形成肿瘤特异性疫苗效果的临床干预。坏死和凋亡细胞的死亡,以及急性炎症形式的手术激活和诱导抗原,从而诱导免疫细胞和T细胞的扩张。而单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV-TK)蛋白可诱导T细胞增殖和炎症性细胞因子的产生,这种免疫刺激环境形成一种系统性的抗肿瘤免疫反应,导致自体肿瘤相关抗原的释放。有许多研究显示,腺病毒-TK局部瘤体治疗能够抑制转移瘤的产生。本文中作者分别构建了Ad5-tk和Ad5/35-tk不同滴度的腺病毒,并且结合不同浓度的更昔洛韦后观察其对膀胱癌细胞活性的影响。

 

本实验也检测了2种不同的腺病毒滴度,在更昔洛韦不同浓度治疗下,检测转染Ad5-tk和Ad5/35-tk后对BHK细胞毒性的影响(如下图)。

 

以上结果表明,BHK细胞中特异性表达CAR和CD46受体的能分别促进Ad5和Ad5/35腺病毒的基因转导效率,且在转染Ad5/35-tk与Ad5-tk相比,细胞毒性更强,存活能力更低。

 

三 、CD46促进了Ad5/35在高表达CD46的膀胱癌细胞中的基因转导

为了进一步证明腺病毒是通过特异性靶向CAR和CD46中发挥腺病毒基因疗法作用的,课题组同时设计了5组细胞系:EJ, 5637, J82, T24和HT-1376。其中CAR只在EJ, 5637两种细胞中呈现高表达,CD46在5种细胞系中均是高表达(如下图)。

为了进一步确定CD46在高表达的细胞中影响Ad5/35的基因转导效果,在细胞中采用慢病毒进行过表达和干扰CD46,而后同时检测CD46和CAR的表达。

 

结果显示:过表达和干扰CD46后不影响CAR的表达。携带GFP的Ad5或者Ad5/35的腺病毒转染入干扰CD46的细胞系中,Ad5/35-GFP的荧光表达水平下降,而Ad5-GFP的荧光表达水平不变(如下图)。

本文作者也检测了2种不同的腺病毒滴度下,在更昔洛韦不同浓度治疗下,检测转染Ad5-tk和Ad5/35-tk后腺病毒对细胞毒性的影响。

 

结果显示:在Ad5-tk联合更昔洛韦治疗作用下,细胞毒性不依赖于CD46的表达水平变化,且Ad5/35-tk转染后过表达CD46的稳定细胞系细胞毒性增加,活性下降。(如下图)。



 

四、CD46促进了Ad5/35在体内膀胱癌细胞中的基因治疗

为了进一步验证被Ad5/35 tk/GCV靶向的CD46在体内的治疗效果,课题组设计了裸鼠皮下移植瘤实验。课题组选择了同时表达CAR和CD46的EJ膀胱癌细胞系,将过表达和干扰CD46及对照组膀胱癌细胞系进行裸鼠皮下移植。当肿瘤体积生长到150mm时,在第1 天和第10天瘤内注射Ad5tk和Ad5/35 tk,和第 2天注射75mg/kgGCV。

 

结果显示:Ad5/35 tk/GCV显著抑制了CD46过表达细胞系时肿瘤大小和体积,而Ad5 /tk/GCV却没有影响3种细胞的体内肿瘤大小和体积(如下图)。

由以上结果可知:本文构建的新型的不依赖于CAR 的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/35, 可以有效杀伤 CAR 低表达的膀胱癌细胞,显著提高膀胱癌溶瘤腺病毒基因治疗的有效性,为其它肿瘤的溶瘤腺病毒基因治疗提供了理论基础和依据。