单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus, HSV）属于疱疹病毒科 a 病毒亚科，其在感染神经元后具有沿顺行方向传递的特性。因此一直被认为是顺行标记神经环路的理想工具病毒载体。虽然不断有基于 HSV 的相关产品推出，然而在实际应用中一直存在毒性强、荧光弱等问题。

 

吉凯基因有幸与国内病毒专家合作，获得减毒改造产品，成功推出新一代高效顺行跨突触标记的HSV。该工具病毒能特异性靶向神经元细胞并严格顺向跨突触复制，实现顺行跨单级和多级突触高亮标记神经环路。具体结果如下：

 

  

 严格的顺向传递 

  

 

利用体外微流控板，在多微管道培养板中培养神经元，H129-G4 感染上游或下游神经元，结果发现其在感染神经元后传递方向具有严格的顺向性（图 1），即只从胞体传到轴突末梢而后跨过突触传递至下一级神经元，不存在由胞体逆向跨突触传递至上一级神经元的轴突的现象。

 

 

 

  

 顺行跨多级突触标记神经环路 

  

 

选用 Ⅰ 型HSV的 H129 毒株，在其基因组中插入四个 GFP 基因获得重组病毒 H129-G4。在小鼠初级运动皮层（M1）注射该病毒，4 天后观察结果如图 2 所示：发现 H129-G4 能够标记 MI 下游多级投射神经元，且神经元细微结构清晰, 荧光信号亮度高，满足了 fMOST 成像要求。

 

a. 小鼠 M1 投射示意图。b-c.  1´10⁶ pfu H129-G4 注射小鼠 M1，注射后第 4 天检测注射位点、对侧 M1 和 S1 等脑区的 GFP 标记信号，以及投射轴突束被标记的情况。d. 被清晰标记的单个神经元。e-j. M1 投射网络 fMOST 检测结果。

 

不仅在啮齿类动物，H129-G4 同样能够标记示踪树鼩大脑神经环路，并清晰展示单个神经元的形态和细节（图 3）。

 

a. 树鼩和小鼠脑大小比较。b-g. 5´10⁶ pfu H129-G4 注射树鼩 M1，4 天后检测注射位点（b）和不同脑区 GFP 标记情况（c-g）。h. 被 GFP 清晰标记的单个神经元。

 

  

 顺行跨单级突触标记神经环路 

  

 

通过在 H129 基因组中敲除TK基因构建 H129-△TK-tdT，并构建 AAV-TK-GFP。在小鼠 VPM 脑区先后在同一位点注射 AAV-TK-GFP 和 H129-△TK-tdT，结果如图 4 所示，清晰标记出了 VPM 区神经元直接投射的下一级神经元。

 

a. 实验安排示意图。b. 小鼠 VPM 环路示意图。c-d. 辅助病毒和 H129-△TK-tdT 单独注射对照。e-h. AAV-TK-GFP 和 H129-△TK-tdT 按照图 a 注射到野生型 C57BL/6 的 VPM，其后按照图 a 标注的时间点检测注射位点（e）的传播起始神经元及其它脑区的跨突触传播后的标记信号（f-h）。

 

在实际研究中往往需要对特定类型神经元的投射环路予以研究，通过构建 Cre 依赖的辅助病毒可实现细胞特异性标记特定类型神经元的投射环路（图5）。

 

a. 实验安排示意图。b. nRT 区 PV 神经元投射示意图。c-d. 单独注射 AAV-DIO-TK-GFP（c）和 H129-△TK-tdT（d）单独注射后均不传播。e-j. 按照图 a 将病毒先后注射于 PV-Cre 小鼠的 nRT 区，其后按照图 a 标注的时间点检测注射位点（e）的传播起始神经元及其它脑区的跨突触传播后的标记信号（f-j）。

 

此外，HSV 基因组为双链 DNA，大小约 150 kb，且近一半为非必需序列，这就意味着 HSV 病毒载体具备极大的包装容量。因此后续我们将继续努力，开发携带功能元件的病毒载体，满足大家对神经环路功能研究的需求。

 

综上，结构优化的 HSV 结合吉凯基因先进的生产平台，大规模生产低毒、高效的顺行跨突触传递的神经环路示踪病毒，助力各位老师更好地开展神经输出环路的结构和示踪研究、特异性神经元投射示踪研究、不同疾病模型中神经环路投射变化及恢复情况研究以及追踪中枢脑区调控器官的投射通路研究。

 

 

附产品列表：