RNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修饰通过影响mRNA稳定性、翻译、转位调控RNA代谢，进而调控多种生物通路。近年来m6A被认为是宿主免疫细胞区分自身和非自身的重要机制，也可能是病毒免疫逃避的一种机制，然而m6A在先天免疫中的作用尚不清楚。

 

2019年4月23日，中国医学科学院北京协和医学院在《Nature Communications》（IF：12.353）上发表了题为“Mettl3-mediated mRNA m6A methylation promotes dendritic cell activation” 的文章，揭示了RNA甲基化转移酶Mettl3介导的m6A修饰促进树突状细胞（DC）功能活化的分子机制。

 

研究方法

 

首先，作者利用DC模型检测m6A修饰在DC成熟过程中的表达情况，发现成熟DC（maDC）中m6A修饰水平及其甲基转移酶水平显著升高（图1.a b）。随后在转录组水平，作者利用免疫沉淀联合高通量测序技术（meRIP-seq）分析m6A修饰，富集到高置信度的m6A峰，GO富集分析发现这些转录本聚类在免疫系统和炎症反应中（图1.e）。

 

图1. m6A修饰水平在maDC中升高

 

接着，作者在DC中特异性缺失Mettl3基因（Mettl3KO），研究m6A在DC成熟和功能中的作用，发现Mettl3基因缺失，共刺激分子表达下降，促炎细胞因子的产生受损（图2.a-d）。

 

使用吉凯基因提供的慢病毒产品Lenti-Mettl3(M3-Wt)和Lenti-Mettl3分别过表达野生型Mettl3（M3_Wt）和突变型Mettl3，过表达M3_Wt可恢复正常功能，过表达突变型没有这种效果（图2.f、g），表明Mettl3介导的m6A修饰促进DC的成熟和促炎细胞因子的分泌。

 

图2. Mettl3以催化m6A的方式促进DC成熟

 

此外，作者还检测了Mettl3 KO的DC促进T细胞增殖的情况，通过体外和体内实验发现Mettl3的m6A催化活性是DC促进T细胞增殖功能必需的（图3）。
 

图3. Mettl3催化m6A的方式促进DC催化T细胞增殖

 

作者进一步研究了Mettl3介导m6A促进DC成熟和活化的分子机制。RNA-seq发现Mettl3缺失导致TLR4/NF-κB通路下游的分子表达下调（图4.a、b），测量该通路分子的表达和磷酸化水平，发现分子的表达和磷酸化水平显著降低（图4.e），表明基因的下调可能由转录活性降低导致。

 

图4. Mettl3在DC成熟过程中增强先天反应和NF-κB通路信号传导

 

然后作者探究了Mettl3是否是通过m6A依赖机制调控Tirap、CD80、CD40的表达。发现Mettl3KO maDC中CD40和CD80在蛋白水平、m6A修饰水平降低（图5.a-c）。基因组核糖体分析发现，Mettl3KO maDC中蛋白的翻译效率降低（图5.d、c）。

 

图5. Mettl3在体内促进Tirap、CD80和CD40 mRNA的翻译

 

同时，体外实验也得到类似的结果（图6），表明Mettl3介导的m6A修饰促进了Tirap、CD40、CD80的翻译表达。

 

图6. Mettl3在体外促进Tirap、CD80和CD40 mRNA的翻译

 

最后，作者使用免疫沉淀反应和基因敲除实验研究了m6A阅读器Ythdf1与CD40和CD80翻译增加的关系，发现Ythdf1可以识别m6A修饰的mRNA，促进CD40和CD80 mRNA翻译（图7）。
 

图7. CD40和CD80的m6A依赖性翻译增强与Ythdf1呈正相关


总 结

 

1. Mettl3介导的CD40、CD80和Tirap的m6A在促进DC活化和成熟中起重要作用；

2. CD40和CD80的上调表达有助于DC的抗原呈递和T细胞刺激；

3. Tirap的高表达增强了TLR4/NF-κB信号，提高了促炎细胞因子的分泌。

 

吉凯助力

 

该研究中慢病毒产品：Lenti-Mettl3、Lenti-Mettl3及对照病毒均由吉凯基因提供。通过感染树突细胞（DCs），使其有效的过表达野生型或突变型Mettl3，进而帮助证明了Mettl3通过催化m6A修饰促进DC的成熟和促炎细胞因子的。