不要让最后的这几个小细节毁了你的实验

大家都知道使用工具病毒感染动物组织时工具病毒的载体选择、注射方法和用量非常重要，往往都要反复跟我们确认，生怕选的不合适导致实验失败。但在病毒注射后进行效果检测时，却显得非常随意，等到实验结果不好时来咨询才发现在样本处理或检测方法上出了问题。浪费了时间和样本不说，严重的可能导致原本应有的阳性结果得不到而错过一篇SCI。

本文我们总结了样本处理及检测中容易犯错的四个步骤供参考，希望能帮助大家获得更好的实验结果，避免因一时失误使自己的实验倒在黎明的前夕。

动物的血液具有很强的自发荧光，在检测荧光信号时会导致很强的背景产生，此外血液还会影响组织蛋白提取液的吸光度，造成蛋白浓度测量不准确而导致WB中内参蛋白条带不均一。所以一般在取组织样本进行检测前都要进行心脏灌流，即利用生理盐水或PBS洗去血管中的血液，从而排除血液对后期免疫荧光、WB等实验的影响。而在心脏灌流时，我们需要注意：

A、一定要等到动物彻底麻醉（掐四肢或肌肉无任何反应）后方可进行灌流，若麻醉不彻底，动物抖动会影响进针角度及位置，可能造成灌流不彻底；

B、 灌流速度要先快后慢，若后续只做切片染色则可继续有4%多聚甲醛灌流，若做WB则只用生理盐水或PBS即可；

C、不用4%多聚甲醛时要注意结束后快速取材（像脑组织容易液化，影响样本质量），若操作较慢可将灌流液先放4℃冰箱中预冷并在冰上进行取材操作。

若样本用于蛋白或RNA抽提，则建议样本取出后接着就提取蛋白或RNA（样本中磷酸化蛋白水平等随时间变化明显），如不能立马提取需第一时间液氮速冻并存于-80℃冰箱中。

若样本要冰冻切片用于后期荧光检测或免疫荧光实验等，则需要立即进行梯度脱水处理。

组织进行冰冻切片前需要用蔗糖溶液进行脱水以去除组织中的水分，从而防止在冰冻时形成冰晶刺破细胞破坏正常细胞形态等，在脱水处理过程中需注意：

A、不可将组织样本直接置于高浓度的蔗糖溶液中，以免表面脱水速度过快，导致组织萎缩且中间部分脱水不彻底，需先置于低浓度（20%）蔗糖溶液中，沉底后再换成高浓度（30%）蔗糖溶液使得彻底脱水；

B、 蔗糖溶液长时间存放极易被细菌污染，可能会使得蔗糖浓度变低而导致脱水效果不佳，所以一般建议现用现配。

病毒载体所带荧光蛋白表达情况代表了病毒的感染及表达效率，因此荧光检测往往是研究者首先要做的，且一般都直接将组织切片置于荧光显微镜下观察，看不到荧光就认定病毒无效，甚至把样本丢掉重新来过。这是万万不可的，因为：

A、一般冰冻切片获得的组织切片可以直接观察荧光，而石蜡切片得到的组织切片则需要用荧光蛋白抗体进行染色后才能观察的到；

B、 即便冰冻切片的组织，也可能因为固定时间太久、所用溶液pH值等问题导致荧光淬灭，如绿色荧光遇酸易淬灭，所以需要用荧光抗体染色做进一步确认。

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