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实验太难啦，无效敲减怎么解决？靶点设计的新策略拿好啦

人阅读发布时间：2021-11-11 16:32

基因功能缺失是研究基因功能的常用方法之一，当前主要通过 RNAi 或者 Crispr/cas9 两种途径实现。这两大技术已经发展完善，应用极其广阔，但即便针对人区区两万个基因，也没有一家公司能够提供 100% 有效的商业化靶点，换言之，基因的 knockdown 或者 knockout 不是那么简单的。为何呢？

当前靶点敲低的现状

首先，我们梳理下两大技术的商业化产品类型，先说国外的，RNAi 以 sigma 为例，其官网针对每个基因提供六个靶点的产品，同样，张锋的 cas9 文库同样针对每个基因设计六个靶点；国内的绝大多数提供该产品的公司，都是设计 3～5 个靶点，才承诺一个靶点在 RNA 水平有敲低效果。

说到底，无论哪种下调技术，都无法保证设计的靶点一定是有效的，所以才需要同时设计多个，通过验证，找出有效的那个。看到这，你或许有疑问：明明靶点就是针对基因设计的，为何还无效呢？因为靶点的有效性受限于众多因素，以 RNAi 为例，影响靶点的因素包括：

（1）基因的表达水平：表达越低，敲减越难；

（2）RNA 的二级结构：RNA 本身是单链的，其序列某些区域可能互补，靶点就无法结合；

（3）载体结构：不同骨架的载体，表达 shRNA 的水平是有差异的；

（4）细胞系差异：同一个靶点，在不同细胞的敲减效率是有差异的；

当然，影响靶点有效性的因素不单单包含上面的 4 点，我们常常碰到，同一个靶点感染同一种类型的细胞，效率都有差异，这就很魔幻了，无法解释啊。所以，生物类的实验重复率低嘛，当你兴冲冲查到一个高分文献的有效靶点，并定制，最后验证无效，不要怀疑，不是别人造假，这也是正常现象。而 cas9 受限于基因组上 SNP 等因素的影响，即便验证出有效靶点，换个细胞，也可能因为靶点刚好在 SNP 上而无效。

说了这么多，小编不是在贩卖焦虑，而是说明了做基因功能缺失的难处，当然，是本着支招的目的去的，有没有可尝试的手段呢？那就是今天要分享的文献，多靶点串联用于基因下调。前面我们讲了，设计一个靶点可能是无效的，那就设计多个靶点，同时验证，等于做多个备胎，但如果将多个靶点构建在一起呢，不就省略了验证多个的情况吗，效果会好吗？

新思路-多靶点串联验证

Weng¹ 等人针对红色荧光设计了三个靶点，分别构建进入 U6 启动子的载体，同时构建了一个三个靶点串联在一起的载体，并转入带有红色荧光的细胞：

随后，作者从荧光强度、RNA 水平表达活性、WB 水平表达程度三个维度分析，发现三个靶点串联的 DsRed-3shRNA 下调基因的水平都优于三个单独的 shRNA，证实了，多靶点串联的优越性：

dsRed 是外源转入细胞并敲低的，那针对内源性基因，敲低效果如何呢？作者选择卵巢癌细胞高表达的 Akt2 作为靶标，设计单个靶点、双靶点串联、三靶点串联的三种病毒组合，分别感染细胞，结果如下：

若要在同一个细胞中同时下调多个基因，若采取单靶点构建形式，势必要转入多个载体，这无疑会加大实验操作难度，因为不同的载体都需要筛选，费时费力。Fink² 等人采取多靶点串联构建策略，针对不同基因设计靶点串联构建，与单靶点构建做对比，同样证实前者的有效性：

上述针对不同基因设计靶点串联构建的形式，在动物水平应用更加广泛。因为单只动物，其某一部位，注射的病毒量、体积都是受限的，若要同时操作多个基因，难度更大，而多靶点串联对于基因下调则是优选，Platt³ 等人使用单个 aav 病毒，运用 cas9 的方式敲除肺腺癌中前三个显着突变的基因 KRAS、p53 和 LKB1，从而建立了疾病模型：