想做出完美的实验结果？这些荧光蛋白知识必须要知道

荧光蛋白是分子生物实验中最常用的工具，通常用来检测细胞的各种生物学过程。那么，选择哪种荧光蛋白才能做出完美的实验结果？要解决这个问题，就需要我们了解常用荧光蛋白的特性、用途，对症下药，选择合适的荧光蛋白。

最早在1962年，Shimomura等从维多利亚多管水母中分离出了第一个绿色荧光蛋白GFP，含有约238个氨基酸，27KDa，其中第65-67位(Ser-Tyr-Gly)通过自身环化和氧化形成发色基团。另外，GFP不需要与任何底物作用，仅在长紫外光或蓝光下就能发出绿光。

GFP结构及光谱图

但是由于GFP荧光不够强，最大激发光又接近紫外范围，可能会损坏活细胞，后来科学家们通过突变GFP得到了增强型的绿色荧光蛋白EGFP和很多突变体，包括对pH敏感的绿色荧光pHluorin、对酸性敏感的黄色荧光EYFP及蓝色荧光EBFP和青色荧光ECFP等，这些荧光蛋白的出现对于实现同一细胞内的多种荧光标记提供了有力帮助。

常见荧光的光谱图

除了多管水母，在珊瑚虫中也有绿色荧光蛋白ZsGreen，它的亮度高于EGFP。由于突变GFP得不到红色荧光，科学家先是从Discosoma striata珊瑚中分离出了DsRed蛋白，但是它成熟缓慢，有毒，且和绿色光谱重叠，因此不适合作为报告基因。后来，经过一系列改造得到了很多红色荧光蛋白，如光强高于DsRed的DsRed2蛋白。下图提供了常见荧光蛋白的激发波长和发射波长，可以根据实验目的选择合适的荧光蛋白，同时也要看下实验室的显微镜是否满足蛋白的发光条件。

常见荧光蛋白特性

荧光蛋白是一种可视化的编码蛋白，它不需要任何底物辅助，只需要在特定波长下就能发光，而且易于检测，因此被广泛应用于动、植物细胞及真菌内的分子生物学研究。

(1)目的基因可以与荧光蛋白融合、转染细胞，通过观察荧光研究基因的亚细胞定位和表达变化；同时也可以将目的蛋白根据结构域进行截短分别融合荧光，通过观察细胞内荧光的定位差异，推测目的基因的定位信号大致在哪个区域。

EGFP融合全长/缺失部分结构域SDCT1蛋白的亚细胞定位

(2)将目的基因的启动子和荧光蛋白重组构建，把荧光当作下游报告基因，通过观察荧光强弱检测细胞的状态及启动子在不同状态下表达基因的能力。

通过兔Oct4启动子-EGFP报告系统监测细胞分化状态

(3)可以利用荧光蛋白监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。如近红外荧光蛋白(iRFP713)在动物组织中穿透力强，而且它的光吸收和光散射量较低，因此常用于动物活体成像实验中。

iRFP713在Hela/MCF-7细胞和小鼠骨骼肌内的荧光成像

(4)荧光蛋白可以作为生物感受器，通过检测荧光强弱变化监测细胞的状态。如钙离子成像技术，钙离子指示剂GCaMP由EGFP和钙调蛋白、钙调蛋白结合肽M13组成，本身不发光，但当神经元发生去极化时，钙离子内流作用于钙调素-M13，引起EGFP空间结构变化产生绿光，所以通过观察绿光指示钙离子浓度的变化以及明确哪些神经元在放电。

钙离子指示剂GCaMP发光原理(Grienberger & Konnerth. 2012)

(5)可以采用GFP-LC3单荧光/mRFP-GFP-LC3双荧光体系示踪自噬的形成。LC3在自噬形成中发生聚集，无自噬形成时，GFP-LC3蛋白弥散在胞浆中；当自噬形成时，GFP-LC3蛋白转位至自噬体膜上，荧光显微镜下会形成多个明亮的绿光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，通过计数可以评价自噬活性的高低。

而mRFP-GFP-LC3双荧光体系可用于标记、追踪LC3及自噬流的变化。当自噬小体融合溶酶体形成自噬溶酶体时，PH下降，GFP对酸性敏感发生淬灭，而mRFP不受外界影响。因此，可以通过观察绿光的强弱来指示自噬溶酶体形成的顺利程度，通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流的进程。

敲低Atg5/Atg7逆转了吗非处理PC12细胞引起的自噬增加

除了参考荧光蛋白的特性和用途外，以下几点也要作为选择荧光蛋白的标准。

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