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Nature子刊 | CCL2趋化因子表达促进了人类炎性乳腺癌的侵袭
2932 人阅读发布时间：2022-07-05 09:55
炎性乳腺癌(IBC)是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，具有独特的临床和组织病理学特征，但其分子基础尚未剖析清楚。
美国科学家评估了一个IBC细胞系A3250，它在小鼠异种移植瘤模型中再现了关键的IBC特征。研究者使用转录组RNA测序和Olink Target 96炎症panel明确了A3250细胞表达高水平的CCL2趋化因子，且是驱动巨噬细胞扩张的关键因子，并间接促进了肿瘤的生长。总体，基于A3250的IBC模型将为探索IBC独特生物学提供新的见解。研究成果以“High endogenous CCL2 expression promotes the aggressive phenotype of human inflammatory breast cancer”为题，发表在Nature Communication（中科院JCR一区，IF：14.919 ）上。
研究结果
1. 通过原发肿瘤分离建立了一种炎症性乳腺癌A3250，具有侵袭转移特性
A3250乳腺癌细胞系是从一个三阴性炎性乳腺癌（IBC）患者的原发肿瘤中分离并构建的细胞系。STR分析证实该系是独特的,任何现有STR谱的相似性低于55%。A3250细胞表现出比通常研究的三阴性乳腺癌（TNBC）系MDA-MB-231细胞更高的集落形成能力。A3250缺乏雌激素或孕激素受体(ER或PR)，HER2(人类表皮生长因子受体-2，ERBB2)mRNA水平与其他TNBC细胞系相当。与MCF7或BT474肿瘤相比，A3250原位肿瘤也缺乏ER、PR或HER2蛋白。这些数据证实A3250是TNBC细胞系。A3250人异种移植瘤模型显示了人IBC关键的临床和组织病理学特征，也保留了人类IBC的关键特征：A3250原位肿瘤会自发地转移到多个器官，如在6周内转移到前哨淋巴结（腹股沟）或更远的淋巴结（腋窝和肱）。A3250肿瘤也显示出向肺和肝转移的高发生率（89%）。研究表明，A3250来源的肿瘤再现了人类IBC的侵袭性转移表型。
2. 转录组学分析揭示了A3250细胞中与炎症相关的多种通路的激活
为了深入了解侵袭性IBC表型的潜在驱动因素，研究者对A3250细胞进行了转录组学分析。将A3250的基因表达谱与6个人TNBC细胞系（2个IBC和4个非IBC）进行了比较。分层聚类显示，A3250细胞与SUM149 IBC细胞最接近。
IPA分析显示，与MDA-MB-231细胞相比，A3250在与炎症相关的通路中表现出显著的富集，A3250有10个典型通路被激活，其中8个与炎症相关。与IBC3相比，A3250显示了与纤维化、EMT和细胞骨架等相关的通路的激活。与MDA-MB-231和IBC3相比，A3250中PI3/AKT信号通路和肿瘤微环境被激活，信号素信号通路失活。与SUM149相比，A3250仅显示5条通路富集，其中与脂质代谢和炎症相关的LXR/RXR典型通路上调最为显著。
基因集富集分析(GSEA)分析显示，A3250与MDAMB-231相比有34个基因集显著富集，与IBC3相比有31个基因集显著富集，与SUM149相比有22个基因集显著富集。在与炎症相关的通路中，与MBA-MB-231、IBC3和SUM149相比，通过NF-κB的标志性“TNFA信号”在A3250中显著富集。A3250相比MDA-MB-231和IBC3也存在JL6 JAK STAT3信号的富集。总体，IPA和GSEA分析表明A3250中多种炎症通路的激活。
3. A3250 IBC肿瘤引起明显的局部和全身炎症
病理学家对IBC中炎症浸润的程度和意义有不同的看法，人们普遍认为炎症是癌细胞堵塞真皮淋巴管的结果。因此，研究者试图与淋巴管浸润（LVI）相比，描述A3250肿瘤中炎症细胞积累的动力学。免疫染色显示炎症细胞在肿瘤侵袭皮肤淋巴管之前就已经积累了。丰富的炎症细胞富集可能是由于肿瘤来源的细胞因子的积极招募，而不是由于肿瘤栓塞阻塞淋巴管引起的。免疫染色进一步显示，在整个存活的A3250肿瘤和邻近的真皮中，F4/80+巨噬细胞的密度非常高。注射后4周检查了携带A3250肿瘤的小鼠的肺，H&E染色显示肺结构异常，其特征是密集的炎症浸润和肺泡结构缺失。流式细胞结果显示，与无肿瘤小鼠肺相比，Ly6Chi髓系细胞有增加趋势、血液中总CD11b+细胞、Ly6Chi炎症单核细胞和Ly6Ghi中性粒细胞的比例显著增加。
4. CCL2在A3250细胞和人IBC中高表达
为了确定可能介导A3250肿瘤髓细胞招募的原因，研究者分析了A3250肿瘤和细胞mRNA-Seq结果中趋化因子的表达。A3250肿瘤的结果分析显示，44个趋化因子中10个有表达，其中只有3个（CCL2、CXCL5和CCL20）在肿瘤（体内）和细胞（体外）均高表达，而CCL2的表达量最高。随后，研究者利用Olink Target 96炎症panel检测了A3250细胞上清中的趋化因子，其中CCL2、CXCL5和CCL20蛋白水平较高。研究者分析了包含41个人类IBC和55个非IBC的Van Laere芯片数据，以及包含25个IBC和57个非IBC 的Iwamoto数据。在两个数据集中，IBC的CCL2中位数表达水平均显著高于非IBC。综上所述，这些数据表明，人类IBC，如A3250，通常表现出较高的CCL2表达水平。
5. 趋化因子受体CCR2在A3250 IBC肿瘤模型的髓系细胞高表达
趋化因子CCL2通过CCR2发挥作用，CCR2是主要的趋化因子受体，介导单核细胞和巨噬细胞招募到炎症部位。研究者检测了CCR2在A3250肿瘤、肺和血液的白细胞中的表达情况。结果表明，血液中存在高水平的CCR2+炎症单核细胞和高CCR2表达的髓系细胞与A3250肿瘤和肺转移相关。虽然CCL2在A3250细胞中高表达，但其他激活CCR2的人类趋化因子(CCL7、CCL8、CCL13和CCL16)均未表达。这些发现表明，在A3250肿瘤模型中，CCL2作为关键的CCR2激动剂，并强烈提示CCL2在单核细胞和巨噬细胞招募到A3250原发和转移位点中发挥重要作用。
6. CCL2敲低显著降低了A3250肿瘤的生长、肺转移和炎症表型
为了研究CCL2在A3250肿瘤恶性表型中的功能，研究者对CCL2进行了shRNA敲低(KD)。CCL2敲低可显著抑制肿瘤生长，同时IBC特征的皮肤炎症也显著减少。此外，CCL2敲低降低了肺转移的发生率和总体转移负担。大多数CCL2敲低肿瘤小鼠肺内无大转移，主要表现为弥散性肿瘤细胞，而对照组A3250肿瘤小鼠主要表现为大转移。
CCL2敲低肿瘤免疫细胞的免疫染色显示，肿瘤区域的CD45+细胞显著减少，其中大部分是F4/80+巨噬细胞。肿瘤中CCL2的下调可减少巨噬细胞浸润和全身炎症。
7、 人IBC存在巨噬细胞的富集
最近的一项研究发现了基于不同免疫浸润的不同人类TNBC（三阴性乳腺癌）亚型，从巨噬细胞富集到中性粒细胞富集。为了检验人类IBC是否富含巨噬细胞，研究者分析了41个人类IBC和55个非IBC的芯片数据。分层聚类显示了两类乳腺癌，分别为富集或不富集TAM（肿瘤相关巨噬细胞）基因。富集TAM基因的IBC样本明显多于未富集TAM基因的IBC样本。免疫染色检测巨噬细胞(CD68+)和中性粒细胞(CD66b+)显示，高密度巨噬细胞出现在间质和/或肿瘤细胞簇内。该结果与基因表达分析表明人IBC存在巨噬细胞富集，也与研究者对A3250肿瘤的研究结果一致，进一步强调了A3250肿瘤模型与人IBC的相关性。
研究总结
本研究围绕一个来源于三阴性炎性乳腺癌（IBC）的细胞系A3250进行了研究。A3250细胞及移植瘤模型显示了人IBC关键的临床和组织病理学特征。对A3250细胞和肿瘤的转录组RNA测序发现了显著的炎性特征，结合Olink Target 96炎症panel找到了一个在A3250细胞和肿瘤中高表达的趋化因子CCL2，该趋化因子在IBC的原发和转移位点发挥关键作用。敲低CCL2可有效改善移植瘤小鼠的疾病特征。此外，研究者发现，在巨噬细胞是临床IBC中的一个主导亚群，这意味着耗尽或靶向巨噬细胞的免疫治疗策略可能是很有前途的IBC治疗方法。总体，本研究的结果表明，基于A3250细胞的IBC肿瘤模型将帮助人类进一步了解IBC生物学，并有助于促进IBC靶向治疗方法的开发。
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