急性肾损伤(AKI)是一种病因广泛，破坏性强，以肾功能急剧下降为特征的临床综合征，约10%-15%的住院患者及超过半数的重症患者会受该疾病影响。随着发病率的不断攀升，AKI的早期诊断至关重要，能确保尽早干预或减轻不断发展的肾脏损害。在过去，AKI的诊断主要基于血清肌酐的检测，但对大多数种类的AKI而言，肾小球滤过率降低和肌酐水平升高已属晚期且不敏感的指标。因此，仅依赖血清肌酐水平可能会导致AKI诊疗延误从而导致不良结果。

近年来，新型急性肾损伤生物标志物IGFBP7已被美国食品药品监督管理局批准用于临床不同类型AKI的风险预测。IGFBP7是胰岛素生长因子家族成员之一，不同于家族中其它蛋白1-6，对IGF的结合亲和性较低。与此同时，IGFBP7更是一种存在于AKI患者体循环中的分泌蛋白，人们尚不清楚它是否在AKI进展中起关键调节作用。本研究的结果可能提高我们对IGFBP7在肾损伤中的作用的理解，并为AKI患者开发新的治疗方法提供信息。

2022年6月，安徽医科大学药学院孟晓明教授研究团队在国际期刊《肾脏国际 (Kidney International) 》上发表了题为《胰岛素样生长因子结合蛋白7通过减轻多聚ADP核糖聚合酶1的降解促进急性肾损伤 (Insulin-like growth factor binding protein 7 promotes acute kidney injury by alleviating poly ADP ribose polymerase 1 degradation) 》的研究论文。该研究论文分析了AKI患者、各类动物模型中血清、尿液以及肾脏中IGFBP7的表达变化和定位，通过构建IGFBP7全身性敲除、肾脏条件性敲除小鼠及基因回补实验，发现IGFBP7促进肾脏炎症和程序性死亡的新功能，并通过质谱找到了与IGFBP7相互作用的关键靶蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1（PARP1），并且通过拮抗泛素化E3连接酶环指蛋白4（RNF4），抑制PARP1泛素化降解，促进AKI的发生发展。该研究加深了人们对IGFBP7在肾脏损伤和炎症中功能和机制的认识，也为早期预防和治疗AKI提供了新的思路。

 

研究方法与结果
 

1.急性肾损伤中，人肾活检、小鼠模型和TECs模型中IGFBP7表达增加

IHC显示AKI患者组织中IGFBP7水平明显升高，患者血清及尿液样本中IGFBP7也同样如此。血清IGFBP7水平与肌酐水平呈正相关。荧光染色表明顺铂或缺血再灌注诱导的损伤小鼠中IGFBP7水平同样明显升高，且IGFBP7定位于肾小管上皮。两种小鼠模型中血清和尿液IGFBP7水平均升高，且IGFBP7在mRNA和蛋白水平均持续上调。体外研究同样证实了经顺铂和缺氧复氧(H/R)刺激后诱导了IGFBP7产生。与此同时，结果显示顺铂诱导c-Jun的表达具有时间依赖性，过表达c-Jun后显著上调了顺铂诱导的HK2细胞IGFBP7蛋白水平。ChIP实验结果证实，顺铂刺激增强了c-Jun与IGFBP7启动子区域的结合。

2. IGFBP7的减少可预防顺铂、缺血再灌注及脂多糖诱导的肾功能障碍、损伤和炎症

PCR、Western blot和IHC表明IGFBP7全身性敲除小鼠构建成功。PAS染色显示敲除IGFBP7可以减轻顺铂等因素诱导的小鼠肾脏损伤。BUN和血清CRE水平反映了肾脏损伤的严重程度，同样证实了上述结果。IGFBP7敲除后KIM-1蛋白表达明显降低，IHC染色、Western blotting、real-time PCR和TUNEL染色显示，IGFBP7敲除后KIM-1水平降低，炎症细胞因子的产生减少，减弱了p65NF-kB的激活及AKI小鼠模型中的细胞程序性死亡。

 

3. 条件性敲除IGFBP7可减轻顺铂诱导的肾功能障碍、损伤和炎症

ELISA结果表明条件性敲除IGFBP7的可降低顺铂诱导的AKI模型血、尿中IGFBP7的水平。故在AKI模型中，肾小管上皮细胞可能是IGFBP7产生的最重要来源。电镜观察显示顺铂诱导的IGFBP7 FF组出现质膜破裂、细胞器肿胀、细胞器内容物丢失等病理现象，但在IGFBP7 cKO组得以缓解。同时，IGFBP7 cKO组中KIM-1、炎症细胞因子和程序性细胞死亡水平也下调了。

 

4. 恢复全敲小鼠中IGFBP7后，顺铂诱导的肾损伤和炎症加重

为了进一步阐明IGFBP7的关键功能，使用IGFBP7过表达腺相关病毒恢复了敲除小鼠中的IGFBP7的表达。恢复IGFBP7表达后增加了BUN、血清CRE水平和肾脏损伤，IHC和Western blotting显示恢复后诱导了KIM-1和炎症细胞因子的产生，并激活p65 NF-kB通路和程序性细胞死亡。

 

5. IGFBP7与PARP1的BRCT结构域结合，并通过拮抗E3连接酶RNF4抑制PARP1的泛素化

LC-MS/MS结果表明顺铂诱导的HK2细胞中IGFBP7和PARP1结合评分显著升高。Co-IP结果证实IGFBP7与顺铂刺激的HK2细胞中PARP1结合增强，IGFBP7或PARP1过表达后也增强。此外，Co-IP研究了IGFBP7与全长PARP1或各种截断突变体之间的相互作用。结果表明，IGFBP7主要与PARP1的BRCT结构域相互作用。并且IGFBP7通过抑制蛋白酶介导的PARP1降解来增加PARP1的表达。

Co-IP结果确定IGFBP7上调后， PARP1泛素化水平降低。UbiBrowser预测了PARP1的泛素化区域，结果显示泛素E3连接酶RNF4和IGFBP7与PARP1结合区域有大量重叠。特异性泛素E3连接酶RNF4可以靶向类泛素化修饰PARP-1，随后被泛素蛋白酶体系统进行标记降解。IGFBP7上调显著降低了PARP1和RNF4之间的相互作用强度。结果表明IGFBP7通过拮抗E3连接酶RNF4抑制PARP1的泛素化。

 

结 论

总之，结果表明在各种因素诱导的AKI中，IGFBP7在TECs中高度表达，其通过c-jun依赖机制表达升高，同时通过拮抗E3连接酶RNF4增加PARP1的表达，在体内和体外均可加重肾脏炎症和损伤。这项研究强调了新型生物标志物IGFBP7信号通路在多个水平上的药理靶向作用，如抑制IGFBP7/PARP1轴，可能代表未来新的AKI治疗策略等。

 

吉凯助力

本文IGFBP7, PARP1和RNF4沉默质粒、IGFBP7过表达病毒均由吉凯基因提供，助力高水平科学研究。

 

作者简介

安徽医科大学药学院孟晓明教授和安徽医科大学第一附属医院泌尿外科王伟副教授为该论文的并列通讯作者，药学院博士研究生庾聚涛为第一作者。

公众号底部菜单栏【新功能】上线！

病毒实验帮 

免费在线学习《国自然热点研究》、《数据库及软件操作教程》
一键下载《病毒使用手册》、《高分文献》

还有不定时的送新书、抽奖活动，赶紧来扫码关注一波吧