软骨是关节中起到承重、润滑作用的重要结构。软骨损伤疾病给人类的运动系统的疼痛和行动障碍造成巨大的影响。然而软骨组织因为缺乏血管和神经的分布从而导致再生能力不足，因此在损伤时缺乏足够的自我修复。软骨的异常修复导致的最常见的结果就是纤维软骨的形成。纤维软骨是软骨在机械磨损或运动损伤后自我修复的副产物。相对于关节中天然的透明软骨，纤维软骨缺乏正常的抗压抗磨损的生物功能，因此其存在会造成软骨退变进一步发生。但是，目前仍没有针对关节纤维软骨的有效解决方案。
近日，来自南京大学医学院附属鼓楼医院运动医学与成人重建外科史冬泉团队在Science Advances上在线发表了题为Articular fibrocartilage-targeted therapy by microtubule stabilization的工作。该工作首次提出基于纤维软骨为基础的透明软骨修复策略，并命名为“纤维软骨透明化”。同时，利用微管稳定的机制有效促进纤维软骨细胞的纤维化指标下降，提高透明软骨细胞外基质的合成，证明了纤维软骨透明化的可行性和有效性。


研究思路及方法

1. 构思纤维软骨透明化策略

纤维软骨一直被认作为软骨修复失败的标志。作者认为纤维软骨作为自我修复的产物有其自身价值（1、纤维软骨可直接作为软骨修复的 自体生物支架；2、纤维软骨中含有天然的种子细胞；3、新生纤维软骨与宿主软骨/ 软骨下骨高度一体化），因此假设存在一种可以利用纤维软骨作为原生材料来实现透明软骨修复的方法。基于此，提出了一个崭新的软骨修复策略-“纤维软骨透明化”，实现纤维软骨透明化策略主要包括两个角度，其一针对原位的纤维软骨细胞进行改造，其二针对原位的纤维软骨机制进行重塑（图2）。
2. 探索纤维软骨形成过程的变化

作者首先在SD大鼠的股骨滑车沟内构建了软骨缺损模型，分别在手术后第2周，第4周，第6周获取了大鼠膝关节样本。在进行组织学分析后发现大鼠软骨损伤过程中，在缺损区域内形成的新生软骨组织均是同时还表达一型胶原（Col I）和二型胶原（Col II）的纤维软骨组织。与此同时，在人的纤维软骨组织内，作者还发现其具有较高表达的金属基质蛋白酶-13 (MMP13), 说明纤维软骨同时具有较高的分解代谢水平，会对自身和周围健康软骨组织造成进一步影响。进一步分析发现，作为稳定微管的标志物，乙酰化的微管蛋白（Ace-tubulin）在纤维软骨中从损伤早期到晚期的表达是明显下降的。同时基于作者前期的研究工作中微管稳定可以促进滑膜间充质干细胞成软骨分化（JW Li et.al. 2021. Front Cell Dev Biol），说明纤维软骨的形成和微管稳定存在一定联系。
 3. 纤维软骨细胞体外模型的建立

作者通过结缔组织生长因子（CTGF）和转化生长因子（TGF-β1）对大鼠骨髓间充质干细胞的诱导获得了诱导性的纤维软骨细胞（induced fibrotic chondrocytes，iFCs）。对获得的iFCs进行mRNA转录组学测序分析，结果发现iFCs高表达纤维化相关的指标，同时与软骨保护相关的指标有所降低。进一步的蛋白表达实验结果也证实了iFCs的纤维软骨细胞表型。
 4. 体外微管稳定治疗纤维软骨细胞

作者使用经典微管稳定药物多西他赛（Docetaxel）作用与获得的iFCs，随后进行mRNA转录组学测序分析，结果表明基因组中纤维化相关的基因，如Col1a1，Fmod以及Col3a1表达都有所下降，另外与细胞骨架相关的基因有所上升。蛋白表达检测实验进一步证实了该结果。同时，软骨小球培养实验和软骨微团培养试验也证实了微管稳定在纤维软骨透明化中的潜能。
5. 构建纤维软骨靶向治疗体系

基于此，作者根据纤维软骨的电荷特性，设计了一种靶向纤维软骨的药物缓释体系，用于体内的纤维软骨透明化治疗。合成后的生物支架能够在29℃左右交联成胶，因此在低温情况下能有效完成膝关节腔的注射操作，利于治疗的进行。同时因为生物支架中的颗粒携带负电荷，因此能够在注射后有效的粘附与纤维软骨表面，进行药物缓释。 6. 微管稳定促进纤维软骨透明化

作者将构建好的纤维软骨靶向治疗生物支架在大鼠软骨缺损模型建立后的第四周进行膝关节腔注射治疗。免疫荧光实验结果显示治疗组损伤区域的Ace-tubulin表达明显升高，说明微管稳定得到有效提升。通过MicroCT以及进一步的组织学分析，结果表明在大鼠软骨缺损模型构建后的中晚期（纤维软骨形成后），可以观察到在损伤区形成的纤维软骨重新展现出了透明软骨的表型，从而基本验证了通过微管稳定实现纤维软骨透明化的可行性。
7. 微管稳定促进人退表软骨的透明化表型

作者获取全膝关节置换术后人膝关节软骨样本，将其分为对照组和微管稳定组进行外植体培养试验。在外植体培养中，多西他赛孵育能够明显提高软骨细胞的Ace-tubulin的表达水平。进一步的蛋白表达试验和组织学分析均表明，微管稳定能够有效将退变纤维软骨往透明软骨的方向转变。
8. 微管稳定促进纤维软骨透明化的机制探索

作者通过对两次mRNA转录组测序分析的结果进一步分析，发现Sparc基因在纤维化时升高，微管稳定时降低，结合蛋白互作分析（PPI）进一步说明该基因为纤维软骨形成以及微管稳定促进纤维软骨透明化的机制密切相关。通过动物实验体内的验证以及小干扰RNA实验对Sparc蛋白的敲减进一步明确了Sparc在纤维软骨透明化机制中的重要作用。
研究总结

该研究首次将纤维软骨作为原材料进行软骨修复治疗，提出“纤维软骨透明化”的全新治疗策略，突破了原有软骨修复研究的传统壁垒。并且使用针对纤维软骨细胞微管稳定的方法验证了纤维软骨透明化的可行性。该研究证实了原位纤维软骨透明化策略在软骨修复中的应用效果和治疗前景，有望成为骨关节炎和软骨损伤相关疾病新的治疗策略和研究方向，也为软骨病理生理机制研究提供新的理论基础。


吉凯助力

本文RNA sequencing and analysis由吉凯基因提供，助力高水平科学研究。


作者简介
南京大学医学院附属鼓楼医院史冬泉教授为该论文的通讯作者，南京大学医学院李嘉威博士为该论文的第一作者。