随着空间转录组测序成为主要的科研手段，小编下面就总结一些我们实操的实验细节，以及项目经验，以供各位老师参考。

新鲜组织的OCT包埋

一、准备工作：干冰（粉末状），OCT（冰上预冷30min以上）

1. 在包埋模具上做好方向标记，用于确定切片方向；
2.在包埋模具中加入1/3或者更多的OCT；
3. 修剪组织，去除组织表面血液或者组织液
4.将组织放入挤有OCT的包埋模具中，调整好位置
5.往包埋模具中继续加入预冷的OCT，完全覆盖组织
6.将包埋模具置于干冰上，盖上干冰盒盖子，或者微敞开放入-80冰箱速冻
7.待组织块变白后，包埋完成，可以连同包埋模具一同保存运输
 
二、新鲜组织OCT包埋时注意事项

1.包埋时尽量排空气泡，气泡的产生会在OCT冷却后在组织周围形成空洞，致使切片时容易断裂 ，影响切片效果, 成不了片；

2.对于需要观察特定切面的组织（如血管横截面等），可以在包埋时在组织底部垫衬与包埋盒底部面积等同的A4纸或滤纸，协助维持组织固定切面。必要时可以借助一些快干胶水做底部固定；

3.对于较小的需要同时几个组织包进一个包埋块时（如类器官等组织），也可以在底部垫衬滤纸或者A4纸，使组织尽可能在同一平面上。

 OCT组织送样

· 新鲜组织取下后建议立即包埋，不建议放在组织保护液里寄送，有降解风险；

· 我们会提前给老师寄一些包埋盒和铝箔纸袋，包埋后的组织密封在袋子里，隔绝外部空气和水分，保存会更好；

· 包埋后的组织放在铝箔纸袋里在-80°C放置一天后再干冰寄送，保证组织的凝固效果同时防止RNA降解；

· 若模型样本老师无法自己取材，可以寄送活体小鼠到公司，由动物平台取材，单细胞平台协助进行OCT包埋。需要支付动物取材及尸体处理等费用，同时需要给到取材的protocal,以及在送样前对包埋的具体位置提出明确需求。

石蜡组织送样

· 石蜡样本保守需要切30-40片，按照一张切片5um的厚度，石蜡块包含组织的厚度至少0.2mm；

· 石蜡样本需在切片前确认切片方向，样本放到石蜡切片机上后无法再次调整方向;

· 石蜡样本采用统一的透化条件，不需要透化预实验，但需要进行粘附性预实验，如果有多个石蜡样本，每一个都需要做粘附性预实验。

空转选片

· 样本收到后10个工作日内我们会给到切片、HE染色以及RNA质检结果；

· 若样本质检合格（OCT：RIN≥7；FFPE: DV200>50%)，   且HE染色形态相对完整，OCT样本需要老师在给到的TTK格式的图片（使用对应软件打开）中选定6.5*6.5mm2的目标区域进行标记，以便安排透化实验；

· 正式实验需要再次选片，需要提前跟老师约好选片时间；

· 空转不能使用免疫荧光的样本，我们可以给老师做免疫荧光的染色来确定位置，OCT包埋好的组织块，切下来的切片先尝试做免疫荧光，并结合HE染色的结构区域，一起摸索可用的区域在哪里，之后紧接着重新切片做HE染色和透化等空转后续实验；

· 如果老师有免疫荧光或者免疫组化的需求，或者需要切出多余的白片寄回给老师，均需要在售前充分沟通，比如需要的白片厚度、需要观察的目的区域结构等，技术平台也会根据经验给出对应的建议。如果老师给到现成的抗体最佳孵育浓度和时间，我们可以使用老师现有参数，给客观结果，否则还需要摸索免疫荧光的条件。

特殊样本空转注意事项

一、骨组织

• 骨组织空转一般质检都比较难通过，特别是对于骨龄比较大的样本；
• 即便质检通过，后面切片也不好切，很容易切碎；
• 骨组织贴片的时候也比较容易脱片；
• 对于石蜡骨组织，样本本身可能细胞也比较少，空转捕获到的spot数可能偏少；
• 骨组织石蜡样本除了容易脱片，且因为不确定透化即RNA释放的效果，不能保证探针对RNA的捕获效率，进而导致最后测到的基因数进一步减少。

二、皮肤组织

• 皮肤组织切片不好切且透化困难；
• 皮肤样本因为分层，切片的时候如果纵切，各层暴露的面积太小，如果横切，则很难切除一平层，这个风险需要老师知晓；
• 如果透化过度，细胞内释放的RNA会弥散，进入附近组织区域，比如说老师这个皮肤组织，可能原本应该是真皮层细胞表达的基因，最后检测分析在皮肤的表皮层的角质层有表达，那就没办法解释；
• OCT包埋以后本身组织就是一团了，切的时候就算客户标记好方向，但因为皮肤层的特殊性，也很难完全正好一类细胞横切一层；
• 如果最后透化失败无法继续向下进行实验，老师也要承担前序包括HE染色、切片、RNA质检、透化等费用。

三、血管组织
 

• 人的血管样本通常有疾病模型，杂质较多，质检不容易通过；
• 血管如果剪开了平切，容易只切到某一种细胞层；
• （内膜/中膜/外膜），不能包含所有细胞类型；如果纵切；
• 由于血管壁的中空结构，包埋时容易产生空泡；
• 小鼠血管较软，相对不容易包埋，对包埋技术要求较高；
• 基于血管壁的厚度（人动脉直径2.8～3.0cm,厚度约1mm;
• 小鼠动脉直径0.8mm,厚度约0.06mm)，取横截面贴片；
• 血管中间的部分是空白的，只要周围一圈血管壁才能覆盖芯片；
• 对空转芯片捕获区域的利用率相对较低。

四、脊髓/骨髓组织

• 脊髓一般分离出来是半固态，长条状，如果要做空转，OCT包埋时候需要老师将脊髓平铺包埋并标记号方向，这个有一定难度；
• 我们质检一般切片厚度10um, 脊髓很薄，不好确定脊髓横切面，有找不到老师要的病理区域的风险，可能切不了几刀就切穿了；
• 骨髓也比较软，不太好包埋，可能组织会变形；
• 切片的时候，骨髓容易切碎（连带着骨头一起碎掉，破坏骨髓的组织形态）。

五、角膜组织

• 需要确定横切还是纵切面，空转一个spot 55μm，点与点之间相距100μm,如果连2个点都覆盖不到，那肯定需要横切；
• 横切的话需要保证在一个平面，如果老师角膜有弧度，包埋需要尽量保证在一个平面；
• 一般小的组织做空转都需要考虑样本的厚度和面积，老师不确定的可以做预实验。