自1983年法国科学家首次分离出艾滋病病毒（HIV）毒株以来，科学家与HIV之间的较量一直未曾停止。随着研究的深入，科学家认为广谱中和抗体（3BNC117）与长效抗艾药物的“双剑合璧”，是HIV功能性治愈的关键。

体外基因编辑B细胞，移植体内以分泌广泛中和抗体(bNAb)，已在疾病模型中显示出疗效。然而，这种方法的临床转化需要专门的医疗中心，技术要求高的仪器，以及供体细胞和患者受体的MHC相兼容。在这里，作者报道了使用双载体AAV的基因编辑技术，其中一种编码saCas9，另一种编码抗HIV的中和抗体—3BNC117[1]。那么，在小鼠静脉注射双载体AAV后，作者能够得偿所愿的找出治疗HIV的新方法呢？今天我为老师们分享一篇文献：In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice. 作者选用血清型为DJ，启动子为CMV的双载体AAV，分别编码saCas9和3BNC117。首先，作者将负责切割DNA的saCas9与负责靶向lgH位点的sgRNA编码到同一个AAV中；负责提供同源修复的编码bNAb的Doner模版，被构建到另一个AAV中（Figure 1AB）。这样，剪接供体序列中的3BNC117 bNAb基因片段，在整合到位点和随后的转录和剪接后，允许其与恒定的IgH外显子融合，可以破坏内源性IgH位点和bNAb作为膜性BCR的初始表达。使得经过改造的B细胞在抗原结合后被激活，从而分化为记忆细胞和浆细胞。
因为B细胞的活化，需要辅助T细胞，所以对小鼠注射AAV前要进行，20μg的gp120 HIV抗原(3BNC117的靶点）进行预免疫。6天后，将双载体AAV注射到C57小鼠体内。然后，在第8、23、68、98、128天接受额外的免疫接种，最终测定C57小鼠血液中的3BNC117 bNAb的含量高达5 μg/ml。实验证明，双载体AAV的设计，可以使3BNC117 bNAb呈现出高滴度的表达（Figure 2）。

 
为了评估基因编辑可能存在的脱靶效应，作者统计了各组织中的bNAb的拷贝数。结果显示：在肝脏和淋巴结内聚集了不应出现的表达3BNC117的B细胞（Fig3 ABC）。此外，对实验小鼠进行全基因组的DNA测序结果也进一步[2]，佐证了CRISPR-Cas9系统存在脱靶效应（Fig3 DE）。

为了解决上述基因编辑中的脱靶效应，作者重新设计的双载体AAV：将Cas9构建到装载B细胞特异性启动子的第一个AAV中，而sgRNA和Doner模版构建到第二个AAV中（Fig 4A），并且对新方案进行了验证，结果显示：基因编辑的转导率没有出现统计学差异，且脱靶效应得到解决（Fig4 D-I）。  
在体内诱导一种特异性、中和性的抗体，是医学界长期面临的挑战。通过改造B细胞，借助AAV，可以使得B细胞持续分泌抗体，且Cas9的脱靶效应在可控范围内。与体外基因工程相比，体内基因编辑B细胞简单、快速、经济[3]。

当然，AAV本身的异质性，基因编辑产生的重链与内源性轻链的配对，也会导致免疫排斥反应。未来的临床转化将会逐步克服这些难题。鉴于AAV助力基因编辑的技术，还会应用在别的疾病谱当中。

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【参考文献】

1.Scheid JF et al. Sequence and Structural Convergence of Broad and Potent HIV Antibodies That Mimic CD4 Binding. Science (80-. ) 333, 1633–1637 (2011).

2.Lazzarotto CR et al. CHANGE-seq reveals genetic and epigenetic effects on CRISPR–Cas9 genome-wide activity. Nat. Biotechnol (2020). doi:10.1038/s41587-020-0555-7

3.Hartmann J et al. A Library-Based Screening Strategy for the Identification of DARPins as Ligands for Receptor-Targeted AAV and Lentiviral Vectors. Mol. Ther. - Methods Clin. Dev 10, 128–143 (2018). [PubMed: 30101151]