以新型药物递送系统为支撑的高端制剂是当今医药领域重要的新药研发方向，其中AAV因为安全性好、宿主范围广、靶向性强被作为基因递送的工具被广泛使用。免疫细胞具有对炎症组织固有的趋向性，在药物靶向递送的方面潜力巨大，已逐渐成为研发的热点。参与非特异性免疫反应的细胞主要是吞噬细胞，包括巨噬细胞和中性粒细胞，还有自然杀伤细胞（NK细胞）。参与特异性免疫反应的细胞主要是淋巴细胞，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。关于AAV在免疫细胞中的靶向策略一直是大家关注的重点方向，接下来小编将从注射方式和实例分析两个部分，分成上下两期给大家进行讲解。

 

免疫细胞不同的注射方式：

用AAV靶向免疫细胞的策略有三种：直接分离感染原代细胞；体外感染细胞再回输；免疫细胞体内靶向注射。直接分离和感染原代细胞主要是针对T细胞；体外感染细胞再回输策略是指从血液中分离免疫细胞，体外培养用AAV感染之后再输送至体内。用AAV为载体的CAR-T和CAR-NK细胞疗法本质就是一种体外靶向再回输的策略；免疫细胞靶向注射就是用不同的方式注射AAV去定向感染免疫细胞。

 

小鼠T细胞分离步骤：

收集小鼠淋巴结：淋巴结通常位于小鼠的颈部、腋窝和腹股沟等部位。使用无菌手术器械，将淋巴结取出并放入含有PBS的离心管中；

制备单细胞悬液：将小鼠淋巴结放入含有PBS的离心管中，用无菌剪刀和注射器将淋巴结切碎，加入含有胰酶和DNA酶的消化液中。将混合物在37℃下消化1-2小时，然后使用无菌过滤器筛选出单细胞悬液；

分离T细胞：将单细胞悬液放入离心管中，加入含有T细胞抗体的磁珠，并在磁力架上进行分离。T细胞抗体能够识别并结合T细胞表面的特定蛋白质，从而将T细胞与其他细胞分离开来。将T细胞分离后，使用流式细胞术或显微镜观察T细胞的形态和数量；

培养T细胞：将分离出的T细胞放入含有营养物质和生长因子的培养基中，进行培养。

 

体外感染细胞再回输^[1]：

针对体外感染细胞主要是巨噬细胞、T细胞和NK细胞。

体外分离巨噬细胞步骤：

腹腔巨噬细胞被分离成单细胞，在腹腔内注射6ml冷的PBS，然后滢注射器和针头吸出4ml腹腔液，分离出单细胞悬浮液；

肝脏灌注之后解剖肝脏和肺部，将其切碎，用500μg/ml胶原酶和400μg/ml的DNA酶在37℃消化30min;

组织通过100μm的过滤器清洗两次；

肝脏进一步在33%离心机中进行进一步处理，700g，15min；

红血球细胞裂解出来，制备单细胞悬浮液。

 

针对免疫细胞的体内靶向注射：

针对免疫细胞的注射方式有尾静脉注射、颈静脉注射、门静脉注射、气管内注射、肌肉注射等

门静脉注射核心步骤^[2]：

暴露门静脉：

对小鼠腹部从膀胱到剑突骨区域做一个2.5cm的皮肤切开；

使用同样的方式打开腹部的肌肉层，使用组织拉钩将打开的皮肤和肌肉固定在左右两侧；

将肠子移动到无菌纱布上并反转胰腺暴露出门静脉，门静脉位于胰腺的底部。

病毒注射：

当门静脉暴露后，向胰腺的门静脉下方2mm处入针；

缓慢的将注射器中的超纯AAV病毒注入血管；

注射完成后，用棉签按压30s,将肠子放回腹腔，缝合皮肤。

 

气管内注射^[3]：

暴露气管：

将麻醉好的小鼠取出仰卧放置在手术板上，用医用胶布固定小鼠四肢并用皮筋穿过门齿固定在手术板上，使其嘴端朝向操作者并呈45°夹角，在小鼠鼻孔上方放置连通气体麻醉系统的软管，确保整个实验过程中小鼠处于稳定麻醉状态；

在小鼠颈部上方放置一强光源（如fiber - lite®高强度光纤柔性光源，Dolan-Jenner Industries, MA United States），使得气管、食管等组织可视化；

用不锈钢的弯头钳轻轻地将小鼠的舌头拉出至嘴的一侧并保持，以便直接看到会厌和喉头；

将钝头的90°弯曲的不锈钢镊子深入到舌下，将舌头小心提起以便可以清楚的看到并进入气管，微调至会厌清晰可见（如光线不足可调整颈部上方光源位置）；

用惯用手将套管针置于食指和中指之间，用拇指稳定套管，引导套管经口和喉头进入气管，至气管分叉处立即停止前进，迅速移除金属导丝，在套管的末端连接气体麻醉系统导管，确保持续通氧气及异氟烷；

病毒注射：

吸取适量病毒，待小鼠稳定时，短暂移去麻醉系统导管，使用移液器将病毒注入套管使小鼠吸入；

再将气体麻醉系统导管与套管相连，维持5~10min；

 

对于AAV在不同免疫细胞中的靶向策略，我们吉凯基因也在收集相关资料整理成册，方便各位老师的查阅参考。下表是针对不同免疫细胞的注射方式，各位老师可以快速查询自己感兴趣的免疫细胞。

具体细胞类型	注射方法
单核/巨噬细胞	尾静脉注射
	体外感染细胞，回输小鼠
	颈静脉
	门静脉（肝巨噬细胞Kupffer）
	气管内注射（肺巨噬）
T细胞	肌肉注射
	腹腔注射
	直接分离培养原代T细胞
B细胞	静脉注射
淋巴管内皮细胞	肌肉注射
树突状细胞	体外感染细胞，皮下注射小鼠
	肌肉注射

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参考文献…

1. Scharenberg, S.G., et al., Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 3327.

2. A, S., et al., - Portal vein delivery of viral vectors for gene therapy for hemophilia. - Methods Mol Biol. 2014;1114:413-26. doi: 10.1007/978-1-62703-761-7_27., (- 1940-6029 (Electronic)): p. - 413-26.

3. H, Y., et al., - Oral instillation with surfactant phospholipid: a reliable alternative to.