可变剪接（Alternative Splicing，AS）是一种进化上保守的转录后过程，增加了真核生物RNA和蛋白质的多样性。人类高达95%以上的多外显子基因能够进行变剪接。

综合转录组学分析显示，肿瘤的选择性剪接事件比正常组织样本多30%。可变剪接已被证明与许多疾病的发生有关，肿瘤相关AS可以产生癌症特异性剪接异构体，其活性影响细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复、侵袭、血管生成、代谢和治疗反应等多种过程。因此，可变剪接的研究，有益于对疾病发生及发展的了解和治疗。
1.多数可变剪接在癌组织和正常组织中发生的频率是不同的，检测这些可变剪接产生的剪接变体有可能作为肿瘤学中新的生物标志物，并且为药物的开发提供大量新靶点。

2.一些在肿瘤中起关键作用的基因的可变剪接产物发挥着不同的功能，直接影响着肿瘤的进展和治疗。

3.还有一些基因，它们的可变剪接可以对肿瘤相关的通路起到调控作用，从而影响到肿瘤的进展。
RNA剪接是由一个被称为“剪接体”的大型核糖核蛋白复合物进行的，它聚集在被称为“剪接位点”的内含子-外显子连接处，并催化内含子去除的反应。

因此，通过CRISPR/Cas9技术对“剪接位点”进行破坏，可以实现目的外显子跳跃。研究发现对目的外显子的两个剪接调控位点同时被破坏，具有最高的外显子跳跃活性。

CRISPR/Cas9靶点设计原则：靶点设计在目标外显子的5 '或3 '剪接位点，cas9介导的靶点切割位点距离剪接位点小于5 bp。

 

利用CRISPR/Cas9技术在目标外显子的剪接位点诱导突变，导致下列四个基因候选外显子跳变。成功地在GSC83细胞中诱导了ETV1-E7、PUM2-E13和SMN-E6外显子跳变(图4C至4E)。在这四种候选基因中，ETV1-E7和NDE1E9的缺失在体外显著损害了GSC83和528细胞的增殖和成球能力(图C至4H)，抑制了GSC83在小鼠大脑中的致瘤性，延长了荷瘤动物的总体生存期(图I)。

通过设计sgRNA，以靶向外显子的3'或5'末端剪接位点，以诱导MPRIP外显子23的跳跃。细胞实验发现，与对照细胞相比，表达这些sgRNAs的BxPC3原发肿瘤细胞在软琼脂中的迁移能力和集落形成能力增强。小鼠实验结果显示，与对照相比，肺转移灶的数量显著增加。

外显子跳跃方法旨在恢复DMD肌营养不良蛋白转录本的中断开放阅读框架。

Duchenne(杜氏)肌营养不良中，第51外号显子不能与第53号外显子连接，这阻碍了其余外显子的组装。科学家们通过设计反义寡核苷酸(AOS)或“分子贴片”的一些DNA的小片段，可以诱导外显子跳跃。反义寡核苷酸（AONs）可以在前mRNA剪接过程中与靶外显子杂交，这将隐藏目标外显子免受剪接机械的影响，并且它将与其侧翼内含子拼接出来。

对于外显子52的缺失，跳过外显子51将恢复阅读框架，第50号外显子可以连接到第53号外显子，并继续制造其余的蛋白质，从而导致肌营养不良蛋白恢复。在Duchenne(杜氏)肌营养不良小鼠模型(mdx小鼠)和Duchenne(杜氏)肌营养不良患者的肌肉活检中证明这种技术是有效的。
吉凯基因可以根据客户的需求，通过设计个性化的cas9 sgRNA靶点，干预目标基因的剪接；借助慢病毒递送的CRISPR/Cas9靶点可长期稳定影响剪接过程。
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参考文献…

1 Comprehensive Analysis of Alternative Splicing Across Tumors from 8,705 Patients.

2 Exon skipping: a first in class strategy for Duchenne muscular dystrophy.

3 Developments in reading frame restoring therapy approaches for Duchenne muscular dystrophy.

4 RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer

5 Alternative splicing and evolution: diversification, exon definition and function.

6 Alternative Splicing: New Insights from Global Analyses.