AAV助力视神经和脊髓损伤的修复，再添新策略

在成年哺乳动物中，切断的CNS轴突不能再生，并且没有有效的再生策略。在发育过程中，神经元逐渐失去延伸其轴突的生长能力，很大程度上导致受损CNS神经元的修复失败。包括PTEN、Krüppel样因子、c-myc和SOX11在内的基因可以调节成熟神经元的内在生长能力，但这些基因靶点都没有转化为临床应用；且这些基因只能增强部分再生能力，仅能实现受损CNS一定程度的再生，因此其它未鉴定的基因可能在CNS修复失败中扮演着重要角色。Lin28a基因是蠕虫和哺乳动物细胞发育和功能多样性所必需的，Lin28a转基因小鼠或通过AAV2为载体介导Lin28a过表达促进损伤后下行脊髓束和视神经轴突的显著再生。因此，Lin28a对调节CNS神经元的生长能力至关重要，可能成为治疗CNS损伤的重要分子靶点。

天普大学刘易斯·卡茨医学院解剖学和细胞生物学系的研究者们，在Tg小鼠中或通过AAV 2感染上调Lin 28 a刺激了成年啮齿动物中受损的CST和视神经的显著和长距离再生，并且还显著促进了RGC的存活。研究成果以“Upregulating Lin28a Promotes Axon Regeneration in Adult Mice with Optic Nerve and Spinal Cord Injury”为题发表在Molecular Therapy Molecular Therapy（IF: 12.4）上。

 研究结果

1. Lin28蛋白在发育小鼠的皮层和视网膜中下调

研究人员评估了不同年龄段小鼠的感觉运动皮质和视网膜中Lin 28 a信号的表达水平。

免疫组织化学和蛋白质印迹法结果显示，在P1-P3（出生后第1—3天）小鼠的皮层和视网膜中检测到Lin28a信号，但随着时间推移信号逐渐减弱，在视网膜中信号从P7开始消失，皮层中则从P14开始，直到成年。免疫染色表明，在皮层中，Lin28a与NeuN共定位，在视网膜中可与TUJ1共定位。由于Lin 28 a控制多种细胞类型的生长程序，成年哺乳动物脑和视网膜中Lin 28 a水平的降低可能导致发育期间或损伤后成熟神经元生长能力的降低。

2. Thy1启动子上调Tg小鼠CNS区Lin28a的表达

为了研究Lin28a基因在成熟中枢神经系统的功能，研究者将Lin28a的cDNA克隆到Thy1载体的XhoI位点，建立了Tg转基因小鼠。接着，通过免疫染色和蛋白印迹验证了视网膜、脊髓灰质和运动皮质，尤其是第4、5层的Lin28a表达上调，皮质中约80%的NeuN阳性细胞以及视网膜中约50%TUJ1阳性细胞显示Lin28a的强信号。

3. 上调Lin28a刺激脊髓损伤（SCI）的成年Tg小鼠中CSTs强再生

CST轴突是连接皮层和脊髓的直接投射纤维，对于身体和四肢的自愿运动控制至关重要，但再生它们的策略非常有限。因此，研究人员对成年Tg小鼠T8节段背侧进行半切，并于7周后使用BDA进行示踪观测CST再生。在Lin28a Tg小鼠中检测到许多绕过或穿过病变并投射到尾部脊髓中的CST轴突，CSTs和突触素1（Syn）双重标记表明，在损伤尾侧脊髓中，再生的CST轴突存在突触结构。研究员以盲法评估SCI后Lin28a Tg小鼠的功能恢复。在背侧过度半切SCI后两天，所有小鼠具有相似的损伤严重程度，BMS运动评分为3。损伤后数周，与WT对照组的部分恢复，并在3—5周达到平台不同，Lin28a Tg小鼠BMS评分在伤后4—8周持续增长，并多数小鼠具有更好的协调性；值得注意的是，后肢网格行走的评估显示SCI后8周两组小鼠中网格行走错误的数量相似。因此，上调Lin 28a可改善成年Tg小鼠SCI的轴突再生和功能恢复，但稳定的功能恢复可能需要更强的再生。
 

4. Lin28a Tg小鼠视神经在挤压后再生

在确认Lin28a在包括视网膜在内的多个神经元群体中上调后，研究员评估了成年WT和Tg小鼠挤压损伤后17天的视神经轴突再生。以CTB-488为示踪剂示踪视神经轴突，对照组的视神经纤维终止于病变部位，Lin28 Tg小鼠显示强有力地长距离再生，即便在损伤30d后，Lin28a Tg小鼠仍然显示显著的再生，部分轴突再生穿过病变部位＞3mm，在视交叉中检测到CTB和Syn双阳性信号。此外，上调Lin28a提高了视神经损伤后RGC的数量。因此，Lin28a上调的Tg促进可持续的视神经再生，并且还防止轴突切断后RGCs的凋亡。

5. 局部注射AAV 2-Lin 28 a载体有效上调感觉运动皮层和视网膜中的靶蛋白

为了用病毒载体在成熟神经元中过表达Lin 28 a，研究者建立了AAV 2—Lin 28 a载体，并注射到C57BL/6小鼠的感觉运动皮质和玻璃体内。注射两周后，与用AAV 2-GFP处理的对照不同，接受AAV2-Lin28a载体的小鼠感觉运动皮层和注射侧的视网膜中Lin28a显着上调，Lin28a信号主要与皮质中的NeuN和视网膜中的TUJ1共定位。因此，AAV 2-Lin 28 a载体的局部应用有效地转导成年啮齿动物的感觉运动皮层和视网膜中的成熟神经元。

6. 损伤后5天递送的AAV 2-Lin 28 a载体的促进成年小鼠中CST轴突的再生

为了确定在损伤后上调Lin 28 a是否促进体内轴突再生，研究人员在成熟C57 BL/6小鼠的T7处进行背侧过度半切，并且5天后将AAV2-GFP或者AAV2-Lin 28 a注射到左侧感觉运动皮层中，以BDA示踪SCI 8W后CST轴突的再生。结果显示用AAV2-Lin 28 a载体处理的动物在病变区域和尾部脊髓中表现出显着的CST再生，点状Syn信号也共定位于病变脊髓尾部再生的CST轴突，但GFAP染色显示，对照组和实验组的瘢痕大小相似。这说明局部注射AAV2-Lin28a载体后感觉运动皮层中Lin28a蛋白的上调。

7. AAV 2-Lin 28 a载体在玻璃体内治疗刺激视神经轴突的显著再生和RGCs的存活

由于Tg转基因鼠过表达Lin28a的方法并不适用于治疗中枢神经轴突损伤的患者，因此研究人员在对C57BL/6小鼠进行视神经挤压后，立即向玻璃体内注射AAV2-GFP或者AAV2-Lin 28 a，以CTB标记伤后21天视神经再生的轴突。检测结果显示，相较于注射AAV2-GFP，注射AAV2-Lin 28 a促进了视神经显著再生，并提高了RGC的存活。在损伤后1d注射AAV2-Lin 28 a并于伤后45d检测再生效果，发现仍然能实现视神经的长距离再生，部分CTB阳性信号出现在视交叉，远端视神经显示点状Syn信号。因此，通过病毒感染上调Lin28a表达能高效地持续稳定地促进视神经再生，表明编码Lin28a的AAV载体具有巨大的治疗潜力。

8. Akt和S6激酶至少部分介导成年小鼠CNS神经元中Lin28a信号传导的作用

Lin28a如何调控成熟CNS神经元生长的信号通路尚未明确，mTOR信号通路的抑制剂雷帕霉素能够下调Lin28a的部分功能，因此，研究人员检测了在成年Tg小鼠感觉运动皮层中上调Lin 28 a是否会改变PI3K-mTOR通路的激酶活性。与同窝WT对照相比，检测到Tg小鼠的感觉运动皮层中pAkt水平显著提高以及pS6增加的趋势。Tg小鼠中pAkt和pS6免疫染色的皮质神经元数量增加，而皮质p4E-BP1无变化。在成年Tg小鼠视网膜中pAkt和pS6增加。通过测量感觉运动皮层中Thr44/Tyr42处p1/2 MAPK磷酸化的水平和和Thr172处AMPKα的磷酸化水平，发现检测到Tg小鼠中p-Erk和p-AMPKα水平呈现增加的趋势。Akt、S6激酶或可能是Erk和AMPK的激活介导成年小鼠CNS神经元中Lin 28a的信号传导。

 研究总结 

这篇文章通过建立转基因小鼠和病毒载体上调Lin28a的表达，实现了成年啮齿动物受损的CST和视神经显著的长距离再生，并促进RGCs的存活。确定用于操纵成熟CNS神经元再生的新分子靶点非常重要，包括本研究中报道的Lin28a。Lin28a是CNS修复的重要靶分子，并且其表达上调对神经系统疾病具有很大的治疗潜力，即便是单独激活Lin28a也能促进中枢神经系统轴突伤后的强再生，具有转化为临床应用的可能性。研究Lin28a是否也通过突触前调节来控制其他类型的神经元的再生是很有趣的，将Lin28a 表达上调与其它促进中枢神经系统修复的方法相结合也是非常值得关注的。
 

公众号底部菜单栏【新功能】上线！

病毒实验帮 

免费在线学习《国自然热点研究》、《数据库及软件操作教程》
一键下载《病毒使用手册》、《高分文献》

还有不定时的送新书、抽奖活动，赶紧来扫码关注一波吧