自从2013年张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑以来，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击。文库病毒的运用也为靶标的筛选带来了新的方向。上个月刚刚放榜不久的面上和青年基金的结果显示，有十几个项目都和cas9文库相关。关于文库病毒又“火”了起来，很多老师也想要用上文库病毒筛选的技术为自己的文章增色，但是还不是很清楚它的原理以及在文章中的具体运用。接下来就跟着小编一起来学习一下吧。

 

用于高通量筛选文库的形式主要有阵列文库和混合文库两种。

 

前者将单个或数个sgRNA列于芯片或多孔板中进行处理，每孔中的基因编辑序列已知；后者则是用计算机设计待筛选sgRNA文库并富集阳性克隆，随后转至宿主细胞以引入各种基因突变，最终通过高通量测序等方法获得结果。相比之下，混合文库筛选成本低、操作简单且可用于体内研究，能够更全面地覆盖全基因组，侵染的细胞可在长期培养后检测结果。CRISPR 文库多使用混合文库形式进行高通量筛选。

 

文库病毒运用在文章中的流程简单来说分为四步：

1.文库的制备和慢病毒的包装；

2.细胞的感染及抗性的筛选；

3.进行实验组（如加药、加压等）和对照组的处理；

4.测序分析差异基因。通过这样的方式可以筛选得到药敏基因、生存必需基因、耐药基因以及肿瘤增殖和转移相关基因。

 

每个步骤有一些要注意的点：

对于文库的构建而言：针对某个物种，每个基因设计3个或者3个以上的sgRNA,高通量合成sgRNA,然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒载体中。包装GeCKO慢病毒文库，并以低MOI（一般标准<0.3）感染靶细胞，保证一个病毒颗粒感染一个细胞，筛选同时表达sgRNA和Cas9的细胞；每个细胞都只会敲除自身携带的sgRNA对应的一个基因，细胞文库中包含的细胞的数量一般为细胞文库中全部sgRNA数量的100-1000倍。将全基因组敲除细胞库分成两份，其中一份作为实验组施加筛选压力，如：病毒侵染、药物治疗等；另一份作为对照组。根据耐药性、增殖能力、存活能力等表型筛选细胞。最后对于候选基因的选择上将实验组和对照组的细胞分别抽提基因组，PCR扩增sgRNA片段，高通量测序，并进行生物信息学分析。

 

临床科研课题的设计上可以套用吉凯的公式“A基因通过调控B机制影响C疾病的D功能”。这其中最开始的也是最重要的一步就是找到关键的“A基因”。下面借张锋教授13年发表的文献[1]，来介绍一下怎么筛选得到药物相关的基因。首先作者用文库病毒去感染肿瘤细胞系A375，接着用puro对细胞进行筛选。对这些在gRNA介导的基因敲除之后，对细胞给予加药处理，加入化疗药物的抑制剂—PLX。结果发现被敲除了某些基因之后，细胞对PLX出现耐药性。通过高通量测序得到那些由gRNA敲除的基因，这些基因就是相关的耐药基因，作者通过这种筛选方法找到了药物相关的基因NF2。

 

接下来，我们通过一篇高分文献的解读来看看在具体的文章中文库病毒的运用，以及整体的实验设计思路吧。

 

这是今年3月份在cancer cell上发表的一篇文章[2]，这篇文章主要介绍了作为转录和翻译的重要调节因子RBPs(RNA结合蛋白)，在癌症中经常出现调节失调。研究人员利用以RNA结合结构域为靶点的Cas9文库的全面筛选，系统的研究了人类癌症中RBP的依赖性。

 

作者首先通过对TCGA数据库的分析，发现了多种RBPs的表达横跨多种癌症。为了确定RBPs在AML中的改变程度，作者分析了来自TCGA、Leucegene数据库中AML患者的484个经典RBPs的mRNA的表达。在AML失调的RBPs里，作者鉴定了107个明显上调的RBP基因以及140个下调基因。

 

接着作者针对490个RBP基因构建了一个定制的2,900个sgRNA（每个基因约6-8个）文库。将单个sgRNA亚克隆到基于慢病毒的GFP标记（LRG）sgRNA载体，高通量的鉴别了癌症存活相关的基因。

 

将CRISPR筛选与急性髓细胞性白血病患者的转录组分析结合在一起，发现 21 个 RBP 候选者中有8个在急性髓细胞白血病中被选择性地需要和上调。进一步评估了四个候选基因（RBM39、DHX37、SUPT6H、HNRNPH1）所有 sgRNA 在两个独立的AML细胞系MOLM-13和THP-1（MLL-AF9、NRASmut）中都表现出了强大的抑制作用。

 

作者发现符合上述标准的最高得分候选者之一是RBM39，也称为CAPER-α，它是一种以前被描述为与U2AF65和SF3B1相互作用的蛋白质。研究结果显示，与正常造血细胞相比，RBM39在急性髓细胞白血病患者样本中的表达明显更高。进一步研究RBM39的功能，研究人员设计了靶向RBM39的RRM结构域的sgRNA，并证实了RN2细胞中RBM39蛋白的敲除。随后将表达sgRNA的RN2细胞静脉注射到接受亚致死性照射的小鼠体内。通过生物发光成像（图 2C-D），观察到接受 RBM39缺失的RN2细胞的小鼠的白血病进展明显延迟。此外，对晚期发病小鼠外周血的FACS分析发现，携带RBM39 sgRNA的循环白血病细胞比例较低。这些发现与绝对存活期的延长有关。

 

为了确定AML细胞中RBM39的相互作用蛋白，在 AML细胞系MOLM-13中进行了免疫沉淀质谱分析（IP-MS）。共鉴定出54种与RBM39相互作用的蛋白质，它们的富集程度比IgG至少高10-倍。蛋白质组网络分析发现了许多与剪接体复合物和核糖体生物发生相关的蛋白质。蛋白质组学方法还发现了31个与RBM39相互作用的RBPs也出现在CRISPR筛选中。在对急性髓细胞性白血病的基因筛选中，有 15个RBPs表现出很强的性质（>2倍的耗竭）。

 

药物发现的一个新兴领域是小分子药物的特征描述，这些药物可以调节E3连接酶以促进靶向蛋白质降解。观察到与正常造血祖细胞相比，DCAF15 在急性髓细胞白血病患者样本中的表达更高（图 5A）。E7070通过募集DCAF15诱导RBM39降解来靶向剪接。E7070浓度的增加会导致人白血病细胞中 RBM39和HOXA9靶基因（BMI-1和MYB）蛋白水平的剂量依赖性降低。E7070暴露会导致急性髓细胞白血病在体外处理急性髓细胞白血病细胞48小时后，G2/M细胞周期停滞受损，细胞凋亡增加。接下来，通过将表达萤火虫荧光素酶的急性髓细胞移植到免疫缺陷受体小鼠体内，评估了E7070对急性髓细胞性白血病进展的体内疗效。与体外研究结果一致，与药物对照组相比，服用E7070对于两种异种种植模型MOLM-13和OCI-AML3都有很强的抗白血病的作用。外周血和骨髓的FACS分析表明，E7070治疗动物的MOLM细胞大幅减少，细胞凋亡率升高。免疫组化分析骨髓和脾脏中RBM39的表达进一步证实了E7070治疗动物体内RBM39的降解。总体而言，服用E7070明显延长了两种急性髓细胞癌异种移植模型的存活时间。E7070治疗三个不同患者的五个患者衍生异种移植物（PDX）表明，E7070治疗每个病例都能减少白血病负担。总之，这些研究结果表明了E7070对急性髓细胞性白血病的影响优于对正常人造血细胞的影响。

 

综上，作者使用综合性的CRISPR/Cas9结构域筛选靶向RNA结合域的490个经典RBPs来研究RBP与人类癌症的相关性，发现了一个在急性髓细胞性白血病与RBPs互作会上调、且对RNA剪接和急性髓细胞性白血病生存相关的网络。此网络中的关键成员RBM39会影响HOXA9和急性髓细胞性白血病中其它RBPs的表达，RBM39在剪接中的丢失进一步导致了急性髓细胞性白血病剪接体突变的致命性，但也提供了一个使急性髓细胞性白血病耐受RBP剪接突变的治疗策略。在这篇文章中作者使用文库病毒结合转录组分析的方式快速筛选出目的基因，如果各位老师相关实验涉及到基因筛选的相关内容，可以参考上述的文章思路，也欢迎老师们和我们咨询文库病毒相关的信息。

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【参考文献】

1.Shalem, O., et al., Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-87.

2.Wang, E., et al., Targeting an RNA-Binding Protein Network in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Cell, 2019. 35(3): p. 369-384.e7.