针对骨骼系统的AAV靶向策略上期已经介绍了的血清型以及注射方式，这一期我们将继续看看AAV在骨骼系统中的递送。我们将结合一篇用到了吉凯产品的文献^[1]，看看在文章中，采用什么样的AAV递送方案对骨骼系统中进行研究。

 

Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis

Runt相关转录因子-1（Runx1）是软骨细胞与成骨细胞谱系结合所必需的，通过增强脊椎动物发育过程中的软骨和成骨的生成。然而，Runx1在关节疾病中的潜在作用尚不清楚。在本研究中，旨在探讨Runx1在前交叉韧带置换术（ACLT）诱导的骨关节炎（OA）中的作用。结果发现软骨细胞特异性Runx1基因敲除（Runx1f/fCol2a1-Cre）通过加速早期骨关节炎中蛋白多糖和II型胶原的损失而加剧软骨破坏。此外，文献还观察到，在晚期骨关节炎中，生长板变薄和骨化，软骨细胞增殖能力下降，生长板周围骨基质丢失。并且通过腺相关病毒（AAV）在关节软骨中过表达Runx1，并通过减缓早期骨关节炎软骨中骨关节炎的破坏和减轻炎症反应来确定其保护作用。

 

结果1：Runx1基因敲除加重骨关节炎软骨破坏

研究人员首先通过将Runx1^f/f和Col2a1-CreER^T杂交，得到Runx1^f/+Col2a1-CreER^T小鼠。为了探究Runx1在软骨骨关节炎（OA）的病理过程，研究人员通过腹腔注射他莫昔芬在软骨中实现了Runx1的敲除。收集膝关节的组织发现，Runx1在关节软骨和生长板中的表达都显著减少。并且进行体内成像发现，在Runx1CKO组中，观察到关节变形以及组织碎片。通过HE染色以及Masson染色发现，Runx1 CKO组比WT组关节破坏更加严重，并且软骨标志物胶原II（Col2a1）和SOX9的表达量低于WT组。这些结果都表明，Runx1基因敲除加速了全膝关节与关节软骨的破坏。

 

结果2：Runx1基因敲除对骨关节炎晚期生长板软骨病理变化的影响

为了进一步研究Runx1在晚期中的效果，研究人员接下来分析了在前交叉韧带置换术（ACLT）手术24周的股骨的生长板软骨的病理变化。组织学结果表明在生长板软骨以及软骨细胞中增加的骨化基质倾向于直接暴露在髓腔中(图2a)。μ-CT分析显示生长板软骨厚度显著减少（图2b）。相比较WT，敲除组的骨化区明显丢失（图2c）。定量的生长板厚度的分析（图2d）和BV/TV（图2e）证实了这些结果。IHC染色用于用PCNA检测软骨细胞的增殖能力（图2f），显示Runx1敲除OA组中数量增加的软骨细胞失去了其增殖能力。然后，研究人员通过IHC测量Col2a1的表达（图2g）和通过IF测量SOX9（图2h），结果表明与野生型OA组相比，Runx1敲除OA组中Col2a1和SOX9的表达减少。这些结果表明，Runx1基因敲除影响OA晚期生长板软骨的病理进展。

 

结果三：Runx1过表达减缓骨关节炎软骨破坏

接下来，研究人员在体内利用AAV建立了Runx1过表达模型：在ACLT手术恢复3-5天之后，将AAV-Runx1注射到关节腔内，通过体内成像（图3a）显示，AAV-Runx1过表达对软骨的破坏有保护作用。根据HE染色以及Masson染色（图3b）表明，相比较WT组，AAV-Runx1保留了关节软骨的完整性。接着研究人员检测了AAV-Runx1对COL2A1和SOX9表达的影响，结果表明相比较WT组AAV-Runx1组表达量相对较低(图3d)，SOX9与它的趋势相同（图3e）。这些结果都表明，AAV-Runx1过表达减轻了OA的进展并且保护了膝关节的完整性。

 

结果四：Runx1过表达减轻骨关节炎晚期生长板软骨的病理进展

接下来研究人员检测了Runx1过表达对骨关节炎症晚期生长板病理进展的影响。通过HE、Masson染色表明，AAV-Runx1过表达保留了生长板软骨的厚度（图4b）,软骨下部区域的小梁骨也被保留（图4c）。尽管AAV-Runx1过表达的生长板宽度没有达到WT组的宽度。通过IHC结果表明，COL2A1和SOX9的表达高于WT组（图4g）。这些结果证明了，AAV-Runx1在OA病理进程中的作用。

 

结果五：ChIP测序确定软骨病理学中的新基因靶点

为了证实Runx1在软骨病理中的机制，研究人员旨在识别直接结合转录因子Runx1的潜在的基因靶点。首先，用慢病毒在软骨细胞中过表达Runx1，然后用CHIP拉下与此结合的所有DNA片段，结果表明16.22%出现在启动子区域（图5a）。然后通过KEGG通路分析发现富集在Hippo信号通路。然后研究人员通过GO分析出这些靶标的具体分布比例。分析出了五个新的靶点被认为是和软骨相关的。这些靶点是跨膜前后转化1（TAPT1）、蛋白质RIC1同源物（RIC1）、成纤维细胞生长因子20（FGF20），骨形态发生蛋白受体1B型（BMPR1B）和骨形态发生蛋白5（BMP5）。

 

结果六：在软骨病理学，新证实的和Runx1相互作用的致病因子

对这五个靶点进行进一步的实验，研究人员通过CHIP-seq获得基于靶标的19个基序。鉴定了两个基序之后找到了与此作用的三个启动子。为了进一步证明这三个靶标的基因表达，用siRunx1来检查基因的变化（图7a）。结果表明，TAPT1、RIC1和FGF20的基因表达水平在siRNA干扰后12小时降低。接下来，研究人员用慢病毒表达Runx1来检测这些靶标的变化。IHC（图7c-h）表明，蛋白质水平增加。在ACLT手术之后12周，结果表明TAPT1、RIC1和FGF20的基因和对照组一致。综上可以看出，这些是Runx1的结合位点。

 

总结：

在这篇文献中，作者首先使用Col2a1-Cre 小鼠和SOX9-Cre小鼠杂交，获得了Runx1敲除的小鼠，证明了Runx1在成年的骨关节炎小鼠中的作用。在AAV-Runx1过表达模型中，观察到关节破坏、骨关节损伤以及生长板退化。Runx1作为一种多功能的转录因子，会涉及包括BMP信号在内的多种信号转导途径。在这篇文献中，作者通过KEGG检测了与Runx1相互作用的靶标富集分析，发现这些信号通路仍在软骨细胞中发挥优势。总之，这些结果都表明Runx1可能是一种针对OA和骨质疏松有效的治疗靶点。

 

吉凯助力：

在这篇文献中使用了吉凯基因的Runx1的过表达AAV。在ACLT手术之后，AAV-Runx1被注射进膝关节，滴度为1E11vg/ml,5μl/关节。

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参考文献：

1.          Zhou, C., et al., Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis. Bone Research, 2021. 9(1).

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