CRISPR文库是什么？从原理、类型到全基因组筛选，一文讲清

CRISPR文库（CRISPR library）是一类由大量sgRNA组成的高通量基因筛选工具。 与一次只研究一个基因不同，CRISPR文库可以将针对不同基因的sgRNA集中到同一个文库中，再通过病毒载体等方式导入大量细胞，从而在一个筛选体系中同时研究数千甚至上万个基因。

如果把普通CRISPR看作“一把基因剪刀”，那么CRISPR文库就像一个“基因剪刀仓库”：研究者可以一次性对大规模基因集合进行功能筛选，再通过高通量测序分析富集或丢失的sgRNA，定位与目标表型相关的候选基因。

一句话理解： CRISPR文库的核心价值，是把“一个基因一个基因验证”升级为“大规模并行筛选”，从而提高基因功能研究效率。

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1. CRISPR文库和普通CRISPR有什么区别？

普通CRISPR实验通常围绕一个或少数几个靶基因展开。

Cas9蛋白在sgRNA的引导下识别特定DNA位置并进行切割，细胞在修复过程中可能产生插入或缺失，从而使目标基因失活，实现基因敲除。

而CRISPR文库并不是只设计一条sgRNA，而是将针对大量不同基因的sgRNA集中构建成文库。文库规模可以达到数万甚至十几万条sgRNA。

在筛选过程中，这些sgRNA通常被分别导入大量细胞，使不同细胞携带不同的基因扰动信息。随后通过表型筛选与高通量测序，可以判断哪些基因与目标表型相关。

普通CRISPR与CRISPR文库对比

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2. CRISPR文库是怎么构建出来的？

一个典型的CRISPR文库构建过程，可以拆分为以下几个步骤。

2.1 设计sgRNA

针对目标基因设计多条sgRNA。

原文所采用的思路是：一个基因通常设计约3～6条不同sgRNA，以降低单条sgRNA效果不稳定带来的风险。

2.2 批量合成sgRNA序列

通过芯片合成等方式，一次性合成大量sgRNA相关序列，为后续文库构建提供基础。

2.3 构建病毒载体文库

将大量sgRNA序列装入病毒载体，形成可以用于细胞导入的文库病毒。

在实际筛选中，慢病毒常用于把sgRNA导入细胞群体。

2.4 控制导入条件

筛选时通常需要控制病毒加入量，使每个细胞尽量只获得一个主要的sgRNA扰动信息。

这样可以减少多个基因同时受到影响所带来的结果干扰，更有利于后续把表型变化与具体sgRNA对应起来。

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3. CRISPR文库如何筛选关键基因？

CRISPR文库筛选的核心逻辑并不复杂：

1. 将CRISPR文库导入大量细胞；
2. 在特定条件下培养或处理细胞；
3. 比较不同sgRNA对应细胞的存活、富集或丢失情况；
4. 提取细胞中的sgRNA信息；
5. 通过高通量测序分析sgRNA丰度变化；
6. 根据富集或丢失结果反推与目标表型相关的候选基因。

因此，CRISPR文库筛选本质上是把“基因扰动—表型变化—sgRNA测序”连接起来。

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4. 什么是CRISPR正向筛选和负向筛选？

CRISPR文库筛选常见的分析思路包括正向筛选和负向筛选。

4.1 正向筛选：寻找“活下来”或被富集的细胞

在某种选择条件下，如果部分细胞被富集，说明这些细胞携带的sgRNA可能影响了与该条件相关的基因。

例如，在特定处理条件下，某些sgRNA对应的细胞比例明显升高，这些sgRNA对应的基因就可能成为后续重点研究对象。

4.2 负向筛选：寻找“减少”或丢失的细胞

如果某些sgRNA对应的细胞在培养或筛选后明显减少，说明这些基因可能与细胞生存、生长或特定功能密切相关。

因此：

• sgRNA富集：提示对应基因可能与获得某种筛选优势有关；
• sgRNA丢失：提示对应基因可能与细胞生存或关键功能有关。

最终仍需要结合实验体系和后续验证来判断基因的真实功能。

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5. CRISPR文库有哪些类型？

CRISPR文库可以从“筛选范围”和“调控方式”两个维度理解。

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6. 按筛选范围：全基因组文库和定向亚文库

6.1 全基因组CRISPR文库

全基因组文库覆盖范围大，适合在缺少明确候选基因时进行探索性筛选。

它的特点是：

• 覆盖基因范围广；
• 适合发现未知关键基因；
• 数据量较大；
• 对细胞数量、筛选规模和后续分析要求更高。

6.2 定向基因敲除亚文库

亚文库只针对某一类基因集合进行筛选。

例如：

• 表观遗传相关基因；
• 泛素化相关基因；
• 干扰素刺激相关基因；
• 转录因子；
• miRNA相关基因；
• 激酶相关基因；
• lncRNA剪接位点；
• 膜蛋白；
• 凋亡、癌基因/抑癌基因；
• 药靶、激酶、磷酸酶相关基因。

与全基因组文库相比，定向亚文库范围更集中，更适合已经有一定研究方向、希望聚焦特定通路或基因类别的项目。

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7. 按功能方式：CRISPR-KO、CRISPRi和CRISPRa

7.1 CRISPR-KO：基因敲除

CRISPR-KO通过破坏目标基因，使其功能失活。

它适合研究：

• 某个基因失活后细胞会发生什么变化；
• 哪些基因对特定表型具有关键作用；
• 哪些基因可能与细胞生存相关。

7.2 CRISPRi：抑制基因表达

CRISPRi并不一定破坏目标基因DNA本身，而是通过转录抑制方式降低目标基因表达。

适合研究“降低表达”对细胞表型带来的影响。

7.3 CRISPRa / CRISPR-SAM：激活基因表达

CRISPRa用于增强目标基因表达。

在文库筛选中，CRISPR-SAM可以用于大规模基因激活筛选，从“功能获得”的角度寻找与目标表型相关的基因。

不同CRISPR文库功能对比

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8. CRISPR文库可以用来做什么？

CRISPR文库适合大规模、无偏或半定向的基因功能筛选。

重点介绍以下几类应用方向。

8.1 寻找细胞生存相关的关键基因

通过负向筛选，可以发现某些基因被敲除后细胞数量明显减少。

这类基因可能与细胞生存、生长或特定状态维持有关，可作为后续机制研究的候选对象。

8.2 筛选与耐受或耐药表型相关的基因

在特定处理条件下，可以观察哪些sgRNA对应的细胞被富集。

这些基因可能与细胞对处理条件的响应相关，可进一步用于耐药机制或相关通路研究。

8.3 寻找候选作用靶点

通过CRISPR文库筛选，可以从大量基因中快速缩小候选范围，为后续靶点验证提供线索。

需要注意的是，CRISPR文库筛选得到的是候选基因或候选靶点，仍需结合后续验证确认其具体作用机制。

8.4 研究影响处理响应的关键基因

不同细胞或样本对同一处理条件的响应可能不同。

通过基因功能筛选，可以寻找影响响应差异的相关基因，为后续机制研究和分层分析提供依据。

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9. 如何选择合适的CRISPR文库？

可以先回答下面几个问题：

9.1 是否已有明确候选基因范围？

如果没有明确候选范围，通常可以考虑全基因组文库。

如果已经聚焦某一类基因、通路或功能模块，可以优先考虑定向亚文库，以降低筛选规模和数据分析压力。

9.2 希望研究“基因失活”还是“基因激活”？

如果重点观察基因失活后的表型，可以考虑CRISPR-KO。

如果重点研究基因被激活后的表型，可以考虑CRISPRa / CRISPR-SAM。

9.3 是否需要进行细胞谱系追踪？

如果研究重点不是单纯敲除或激活，而是希望追踪细胞群体变化，可以考虑Barcode条形码文库。

9.4 是否有自定义基因列表？

如果已有目标基因list，也可以根据研究目标构建定制化文库，而不必直接使用全基因组文库。

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10. 吉凯基因有哪些CRISPR文库？

吉凯基因（Genechem）提供多种现货CRISPR文库，并支持按目标基因list进行定制。

现有文库包括但不限于：

全基因组CRISPR文库

• 人全基因组CRISPR-KO文库
• 人全基因组CRISPR-SAM文库
• 小鼠全基因组CRISPR-KO文库
• 小鼠全基因组CRISPR-SAM文库

定向基因敲除亚文库

• 人表观遗传基因CRISPR-KO文库
• 人泛素化相关蛋白CRISPR-KO文库
• 人干扰素刺激基因CRISPR-KO文库
• 人转录因子CRISPR-KO文库
• 人miRNA基因CRISPR-KO文库
• 人激酶基因CRISPR-KO文库
• 人lncRNA剪接位点靶向CRISPR-KO文库
• 人膜蛋白靶向CRISPR-KO文库
• 人凋亡、癌基因/抑癌基因CRISPR-KO文库
• 人药靶、激酶、磷酸酶相关基因靶向CRISPR-KO文库

细胞谱系追踪文库

• Barcode条形码文库

如果已有明确的目标基因集合，也可以根据目标基因list进行专属文库方案设计。

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11. 为什么CRISPR文库适合高通量基因功能筛选？

与逐个基因验证相比，CRISPR文库的核心优势在于：

• 可以一次性研究大规模基因集合；
• 适合寻找未知关键基因；
• 可通过正向筛选和负向筛选发现不同类型候选基因；
• 可以结合高通量测序进行定量分析；
• 既可用于全基因组探索，也可用于定向基因集合筛选；
• 可结合CRISPR-KO、CRISPRa/SAM等不同调控策略。

因此，在需要从大规模候选基因中快速找到重点研究对象时，CRISPR文库是一类重要的高通量基因功能筛选工具。

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12. CRISPR文库常见问题 FAQ

Q1：CRISPR文库到底是什么？

CRISPR文库是由大量sgRNA组成的基因功能筛选工具。不同sgRNA对应不同基因，通过把这些sgRNA导入大量细胞，可以在同一项目中并行研究数千甚至上万个基因。

Q2：CRISPR文库和普通CRISPR最大的区别是什么？

普通CRISPR通常针对一个或少数基因进行编辑；CRISPR文库则面向大规模基因集合，核心目标是进行高通量筛选。

Q3：什么是全基因组CRISPR文库？

全基因组CRISPR文库覆盖大范围基因，适合在没有明确候选基因时进行大规模探索性筛选。

Q4：什么是CRISPR-KO文库？

CRISPR-KO文库通过敲除大量不同基因，观察基因失活后产生的表型变化，用于寻找关键功能基因。

Q5：什么是CRISPR-SAM文库？

CRISPR-SAM属于基因激活型文库，通过增强目标基因表达，从“功能获得”的角度进行大规模筛选。

Q6：CRISPR文库筛选完成后怎么找到候选基因？

通常会提取筛选后细胞中的sgRNA信息，并进行高通量测序。通过分析不同sgRNA的富集或丢失情况，可以推断与目标表型相关的候选基因。

Q7：一个基因为什么要设计多条sgRNA？

同一基因设计多条sgRNA可以降低单条sgRNA效果不稳定带来的风险。原文中采用的常见设计思路为每个基因约3～6条sgRNA。

Q8：全基因组文库和亚文库怎么选？

如果缺少明确候选基因，可以考虑全基因组文库；如果已经聚焦某类基因、通路或功能模块，可以考虑定向亚文库。

Q9：吉凯基因是否支持CRISPR文库定制？

支持。除多种现货CRISPR文库外，吉凯基因还可根据目标基因list提供定制化文库方案。

Q10：CRISPR文库筛选结果可以直接作为最终结论吗？

不建议。CRISPR文库更适合用于大规模发现和候选基因筛选。获得候选基因后，仍需要结合独立验证和后续机制研究确认结果。

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13. 总结

CRISPR文库把单基因研究扩展到了大规模并行筛选。

它通过大量sgRNA构建文库，将不同基因扰动信息导入细胞，再结合特定筛选条件和高通量测序，帮助研究者从大量基因中快速定位与目标表型相关的候选基因。

如果研究目标是：

• 从全基因组范围寻找关键基因；
• 聚焦某类基因进行定向筛选；
• 比较基因敲除或激活后的表型；
• 进行细胞谱系追踪；
• 根据自定义基因list构建筛选文库；

都可以根据具体项目选择不同类型的CRISPR文库。

吉凯基因（Genechem）目前可提供人/小鼠全基因组CRISPR-KO、CRISPR-SAM，多类定向CRISPR-KO亚文库及Barcode条形码文库，并支持按目标基因list进行文库定制。

注：不同筛选项目对细胞模型、文库覆盖度、病毒导入条件、筛选压力和测序深度等要求不同，具体方案建议结合实际研究目标进行设计。