CRISPR筛选为什么需要Functional MOI

病毒管子上写着 1×10⁸ TU/mL，于是按公式算了个体积加进去，感染、筛选、测序，几个月后分析发现数据一塌糊涂。问题很可能出在最开始的那一步——用了理论 MOI，而没有实测 functional MOI。

先说结论：MOI（感染复数）是平均每个细胞感染的病毒颗粒数，它决定了每个细胞拿到几条 gRNA；functional MOI 是在实际细胞上实测得到的有效感染复数，区别于按物理滴度算出的理论值。文库筛选要求绝大多数细胞只整合一条 gRNA（functional MOI 约 0.3–0.5），理论值因为不反映真实感染力，往往与实际相差数倍。实测 functional MOI 是筛选项目不可跳过的前置步骤。

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一、为什么理论 MOI 不可靠

MOI 的计算公式很简单：MOI = 加入的病毒颗粒数 ÷ 细胞数。问题在于"病毒颗粒数"这个输入值本身可能失真：

1. 物理滴度不等于感染力

p24 ELISA 或 qPCR 测得的是病毒颗粒或基因组拷贝数，其中相当一部分是没有感染能力的缺陷颗粒（包装不完整、包膜损伤、冻融损失）。物理滴度高而功能滴度低的情况非常常见，两者可以相差一个数量级。

2. 不同细胞系的感染力差异巨大

同一批病毒在 HEK293T 上的感染效率可能是 90%，在 Jurkat 上只有 20%，在某些原代细胞上可能低于 5%。用贴壁细胞测得的滴度去推算悬浮细胞的 MOI，是筛选失败的经典原因。

3. 感染条件的影响

血清、助感染试剂（Polybrene）浓度、感染体积、是否离心、感染时长，都会显著改变实际感染力。理论计算不包含这些变量。

4. 病毒储存与冻融

反复冻融、长时间 4°C 放置都会造成滴度损失。管子上写的数字是出厂时的值，不是你使用时的值。

所以，functional MOI 必须在使用当天、在目标细胞上实测。

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二、functional MOI 怎么测

方法（以带荧光标记或抗性标记的病毒为例）

1. 准备若干份等量的细胞（如每份 1×10⁵ 个，设 5–6 个梯度）；
2. 分别加入不同体积的病毒（如 0、2、5、10、20、50 µL）；
3. 按正式实验的条件感染（同样的培养基、血清浓度、助感染试剂、是否离心、感染时长）；
4. 感染后 48–72 h 检测感染阳性率：

• 带荧光标记：流式直接测阳性细胞比例；
• 带抗性标记：加药筛选后计数存活克隆数，或用有限稀释计数；
• 也可以直接提取 gDNA 用 qPCR 测整合拷贝数。

1. 按泊松分布反推 MOI：

感染阳性率 P = 1 − e^(−MOI)，因此 MOI = −ln(1 − P)

例如阳性率为 30% 时，MOI ≈ −ln(0.7) ≈ 0.36。

1. 作出"病毒体积 → MOI"的标准曲线，据此确定正式实验的加样量。

关键：预实验的条件必须和正式实验完全一致，否则测出来的 MOI 不能指导正式实验。

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三、MOI 高低分别意味着什么

MOI 过高（> 1）的问题

• 一个细胞整合多条 gRNA，表型无法归因到单个基因；
• 按泊松分布，MOI = 1 时约 26% 的被感染细胞拿到了 2 条及以上 gRNA，MOI = 2 时这个比例更高；
• 数据表现为：大量 gRNA 呈现虚假的相关性，命中基因的一致性变差；
• 同时总整合事件增多，Cas9 负担加重。

MOI 过低（< 0.2）的问题

• 被感染的细胞太少，要达到覆盖度需要极大的起始细胞量；
• 未感染细胞占比过高，它们不受编辑、不响应筛选，稀释了信号；
• 需要更多细胞和更长的扩增时间。

为什么 0.3–0.5 是常用区间

这是一个折中：MOI = 0.3 时约 26% 的细胞被感染，其中绝大多数只拿到一条 gRNA（拿到 2 条以上的比例约 3.3%）；同时感染效率不至于低到无法实现覆盖度。

注意：覆盖度的计算必须与感染效率挂钩——起始细胞数 = 文库 gRNA 数 × 覆盖倍数 ÷ 感染效率。MOI 越低，需要的起始细胞越多。

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四、吉凯基因CRISPR相关产品与服务

CRISPR/Cas9慢病毒产品

提供 sgRNA 与 Cas9 慢病毒包装，交付前完成滴度测定与无菌、支原体检测。选型时建议明确索取功能滴度数据及其测定条件，而不是只看物理滴度。收到病毒后仍建议在目标细胞上做梯度感染预实验——这一步通常只需几天，却能避免数月的返工。

CRISPR-Pool文库产品

• CRISPR-Pool KOUT 文库：全基因组敲除筛选文库。文库感染的 MOI 控制直接决定数据质量，成品文库提供明确的滴度与推荐使用方式，配合实测 functional MOI 可确保低 MOI 条件下的覆盖度达标。
• CRISPR-Pool SAM 文库：激活筛选文库，同样需要低 MOI 感染控制。

稳定细胞株构建服务

非筛选类的稳定株构建中，MOI 的目标相反——通常希望较高的感染效率配合抗性富集，让尽可能多的细胞获得编辑元件。服务中会按目标细胞实测感染条件并确定加样量，避免"感染不足导致筛不到克隆"或"感染过度导致多拷贝整合"。

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五、常见问题FAQ

能不能不做预实验，直接按推荐量加？

不推荐。不同细胞系的感染力差异可达数倍甚至一个数量级，推荐量只是参考值。梯度感染预实验的成本（几天时间、少量细胞和病毒）远低于整个筛选失败的成本。

用流式测感染效率，需要什么对照？

必须有未感染细胞的阴性对照用来划定阳性门（gate）。如果病毒不带荧光，可以用抗性标记做克隆计数，或用 qPCR 测整合拷贝数。

按泊松分布算 MOI 的前提是什么？

假设病毒颗粒独立、随机地感染细胞，且细胞群体均一。实际体系中这个假设是近似成立的，因此 functional MOI 是一个估计值而非精确值。但作为实验设计的指导，它的精度已经足够。

已经用错误的 MOI 做完感染了，还能补救吗？

基本不能。如果 MOI 过高导致大量细胞携带多条 gRNA，只能重新感染。这也说明为什么必须在正式实验前完成 MOI 测定——这一步没有事后补救的空间。

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总结

Functional MOI 是文库筛选里主要无法事后补救的前置步骤。理论 MOI 因为物理滴度失真、细胞系差异、感染条件和病毒储存等多重原因，与实际情况常常相差数倍。

正确的做法是：拿到病毒后，在目标细胞上、按正式实验的条件做梯度感染预实验，用流式或抗性计数测定感染阳性率，按泊松分布反推 MOI，把 functional MOI 控制在 0.3–0.5，并据此推算满足覆盖度所需的起始细胞量。吉凯基因提供滴度明确的 CRISPR/Cas9 慢病毒与 CRISPR-Pool KOUT/SAM 文库，配合规范的条件实测，可以帮助把这一步的不确定性降到最低。