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公司新闻/正文
CRISPR KO稳定细胞株怎么构建？
6 人阅读发布时间：2026-10-22 13:11
做基因功能缺失研究，敲低（KD）只能把 mRNA 打下来一部分，很多老师会直接上 CRISPR：
CRISPR 敲除（KO）稳定细胞株到底怎么构建？sgRNA 怎么筛？单克隆怎么挑？"敲除成功"的验证标准是什么？
先说结论：
标准路线是"Cas9 + sgRNA 使靶基因移码 → 单克隆分选 → PCR 测序验证基因型 → 蛋白水平确认敲除"，最终交付 100% 纯合子 KO 稳转株。KO 和 KD 的最大区别是：KO 做的是基因编辑，必须做基因型验证，且通常以单克隆形式交付。
方案确认顺序：
敲除形式（移码/片段缺失/敲入） → sgRNA 设计与活性验证 → 感染与筛选 → 单克隆分选 → 基因型+蛋白验证
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一、CRISPR KO 的三种实现形式
| 形式 | 原理 | 特点 |
|---|---|---|
| KO-移码 | Cas9 在靶位点切割，NHEJ 修复产生 indel，导致移码、提前终止 | 最常用的功能敲除方式 |
| 片段缺失 | 两条 sgRNA 两侧切割，删掉关键外显子/结构域 | 适合去除特定功能域 |
| 敲入 | 借助同源重组在靶位点引入突变或标签 | 属于 KI 范畴，周期更长 |
多数"做一个基因敲除"的研究，走 KO-移码路线即可。
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二、载体系统：单载体还是双载体？
以常用的 CRISPR/Cas9 慢病毒系统为例：
| 系统 | 结构 | 特点 |
|---|---|---|
| 单载体 | Cas9 + sgRNA 装在同一个慢病毒上 | 一次感染完成，流程短 |
| 双载体 | Cas9 与 sgRNA 分别由两个慢病毒递送 | 可先建立 Cas9 稳转工具株，sgRNA 灵活更换 |
双载体系统的典型流程（以吉凯 CRISPR/Cas9 双载体慢病毒为例）：
- 构建 Cas9 稳转工具株：先用 Cas9 慢病毒（带嘌呤霉素抗性）感染目的细胞，药筛获得稳定表达 Cas9 的混合克隆株，冻存备用——这个工具株后续所有 sgRNA 实验都能复用；
- 靶点有效性筛选：将携带不同 sgRNA 的慢病毒（带荧光或新霉素抗性）分别感染 Cas9 稳转株，检测各 sgRNA 的切割效率，只选有效靶点进入稳转株构建；
- 多克隆/单克隆稳转株构建：按需进行。建议先筛出有效靶点再做单克隆，否则克隆工作量和成本会大幅增加；
- 报告基因与维持：第二次感染的载体若带新霉素抗性，后续需同时维持嘌呤霉素 + 新霉素双抗性（各为筛选浓度的 1/2~1/4 或更低）；若带荧光标签，则改用流式分选 GFP 阳性细胞。
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三、单克隆分选：KO 稳转株的核心环节
基因敲除后细胞群是"野生型 + 杂合 + 纯合 + 中间态"的混合体，只有单克隆才能给出确定、均一的基因型。
标准做法：
- 有限稀释铺板：将编辑后的细胞稀释至 1 cell/well（384孔板或96孔板），也可流式分选单细胞；
- 克隆追踪：用活细胞成像（如 IncuCyte）在第7天、第20天等时间点扫描，确认单克隆来源并追踪生长（一般培养3~6周）；
- 逐步扩增：96孔 → 24孔 → 6孔 → 10cm皿；
- 逐克隆验证：基因型 + 蛋白 + 质检，合格克隆冻存保种。
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四、"敲除成功"的验证标准
这是 KO 稳转株与 OE/KD 最大的不同——基因型必须直接测序确认：
| 层面 | 验证方法 | 判定 |
|---|---|---|
| DNA（基因型） | PCR 扩增靶位点 + Sanger 测序 | 出现移码（frameshift）indel；纯合子 = 两个等位基因均破坏 |
| mRNA | qPCR（视情况） | 无义介导降解时可下降；不作为 KO 的充分证据 |
| 蛋白（功能） | Western Blot / 流式 / IF | 蛋白消失或显著缺失，是"真正敲除"的金标准之一 |
| 细胞质检 | 支原体、活力、形态 | 无污染，状态合格 |
关键提醒：
mRNA 下降不能证明 KO 成功，蛋白还在就说明敲除不彻底。 抗体可得性好的基因，务必做 WB 确认蛋白水平完全缺失。
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五、KO 项目最常见的三个翻车点
第一，跳过靶点活性验证直接铺单克隆。 sgRNA 切割效率差异很大，不先在 Cas9 稳转株里平行测试就大规模铺板，结果是几十板细胞里挑不出一个纯合克隆。正确顺序永远是：先测活性，择优进单克隆。
第二，用 qPCR 下降当作敲除证据。 mRNA 下降可能只是无义介导降解，残余蛋白仍然可能执行功能。发表级的 KO 证据需要基因型测序 + 蛋白消失双确认。
第三，忽略野生型对照。 KO 细胞的表型必须有同源背景的野生型细胞做参照，而且最好在同一个实验室、同一培养条件下生长。这也是为什么吉凯交付 KO 细胞株时免费赠送野生型对照——这个对照不是可选项，是实验设计的一部分。
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六、KO 稳转株的三条路：自己做、定制、买现货
KO 稳转株的门槛集中在三处：sgRNA 设计与活性验证、单克隆分选体系、基因型验证能力。评估下来不划算自建的，可以看吉凯基因的方案：
现货优先。 吉凯有 500+ 现货 KO 细胞株（KO、OE、RNAi），常用基因加常用细胞的组合快至 2 周交付，直接跳过整个构建流程。
定制路线。 KO 定制快至 5 周、KI 定制快至 10 周，支持移码、片段缺失、敲入等形式。交付标准很明确：单克隆 10⁶ cells/管×2，编辑细胞默认 PCR 测序验证、100% 纯合子交付，野生型对照免费赠送。抗体有文献且实验验证支持的基因，还有蛋白敲除承诺——也就是说蛋白层面敲没敲干净，平台替你背书。
质检托底。 交付细胞无细菌、真菌、支原体污染，克隆形成率 ≥2.5%、倍增时间 <72 小时，冻存复苏复检合格才发货。这些指标看着平淡，实际决定了细胞到手后能不能立刻开展实验。
如果课题需要的是"真正敲干净、基因型明确、可写进论文"的 KO 稳转株，先把目标细胞和基因对着现货库查一遍，查不到再走定制，是性价比最高的路径。
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总结
CRISPR KO 稳转株的构建主线：
sgRNA 设计与活性验证 →（双载体则先建 Cas9 工具株）→ 编辑与药筛 → 单克隆分选 → PCR测序基因型验证 → WB蛋白验证 → 冻存复检
三条底线：
- 没做靶点活性验证的 sgRNA，不要进入单克隆环节；
- 基因型必须测序确认，100% 纯合子才算合格交付；
- 蛋白水平消失，才是敲除的最终证据。