Puromycin杀灭曲线怎么做？

稳转株药筛出问题的项目里，一多半是因为跳过了这一步：

Puromycin 杀灭曲线到底怎么做？为什么要做？做完之后筛选浓度和维持浓度怎么定？

先说结论：

杀灭曲线就是用一系列 puromycin 浓度处理未感染的野生型细胞，找出"能在 2 天内全部杀死它们的最低浓度"——这个浓度就是正式药筛的工作浓度；筛选成功后再降到它的 1/2~1/4 或更低作为维持浓度。全流程约 3~5 天，是稳转株构建中最不能省的预实验。

操作顺序：

铺板 → 加药梯度 → 48h 观察判读 → 定筛选浓度 → 定维持浓度

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一、为什么必须做杀灭曲线？

Puromycin 通过干扰核糖体翻译杀死未携带抗性基因的细胞，但每种细胞对它的敏感程度差异很大：

一句话：

杀灭曲线的目的，是让你的细胞告诉你答案，而不是让文献告诉你答案。

多数细胞的 puromycin 工作浓度落在 1~10 μg/ml，这个范围只能当起点，不能当答案。

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二、标准操作流程

第 1 步：铺板

• 使用未感染的野生型细胞（对数生长期、状态良好）；
• 提前 24h 铺入 24 孔板，细胞量按生长状态调节，24h 后密度约 70%；
• 每个浓度至少一个孔，建议做复孔。

第 2 步：加药

• 配制 puromycin 梯度，常用分组如：0 / 0.5 / 1 / 2 / 4 / 8 / 10 μg/ml；
• 细胞敏感度低的可再往上加（如 15、20）；
• 换液后加入含药培养基，0 μg/ml 孔作为生长对照。

第 3 步：观察与判读（48h）

• 培养 48h 后显微镜下逐孔观察；
• 判读标准：全部杀死野生型细胞的最低浓度组即为候选工作浓度；
• 注意区分"细胞变圆但未脱落"和"彻底死亡"——判读以细胞完全死亡、无法贴壁为准；
• 48h 仍有存活的高浓度组，可延长至 72h 再确认。

第 4 步：确定两个浓度

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三、筛选阶段怎么用这个浓度

1. 慢病毒感染后 48~72h 开始加药（此时外源基因/抗性基因已有表达）；
2. 必须同步设置野生型 + 等量 puromycin 的对照孔——这是判断筛选是否成功的标尺；
3. 筛选至少 48h，直到空白对照孔细胞全部死亡；
4. 此时实验组存活的细胞即可视为阳性（整合了抗性基因）细胞；
5. 载体带荧光的，待荧光阳性率达到 100% 后转入维持浓度继续培养和扩增。

核心逻辑：筛选浓度由"野生型细胞全死"定义，维持浓度由"阳性细胞状态良好"定义。 两个浓度是两个用途，不要混用。

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四、常见问题排查

加了药，对照孔 48h 没死干净。 浓度偏低或细胞铺得过密。降低铺板密度重测，或提高浓度上限重新设梯度。

药筛后荧光阳性细胞大量死亡。 浓度超过阳性细胞耐受（尤其抗性基因排在 IRES 之后表达弱时），或筛选开始太早。降浓度复筛，并确认加药时间在感染后 48~72h、抗性基因已充分表达。

筛选后细胞状态一直很差。 检查筛选期间换液频率和血清批次；维持浓度可以再降，目标是"压住未整合细胞 + 阳性细胞状态良好"的平衡点。

维持期要不要一直加药？ 要。停药后低拷贝/未整合细胞会逐渐占据群体，表达比例随传代下降。维持浓度可以很低，但不能为零。

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五、把预实验变成标准动作

杀灭曲线只有 3~5 天，却是整个稳转株流程里"性价比最高"的预实验——它换来的是后面几周的确定性。吉凯基因的稳转株流程里，这一步和 MOI 摸索一样是默认环节：针对每种细胞先跑杀灭曲线定工作浓度，筛选时同步设野生型+药物对照孔，空白对照全死、实验组存活才判定筛选成功，荧光 100% 后才转维持浓度（筛选浓度的 1/2~1/4 或更低）。这套标准贯穿 OE、RNAi、CRISPR、报告基因所有稳转株产品线，双载体系统的 puromycin + 新霉素双抗性维持也有一套固定参数。

对课题组的实际建议是：

• 每种细胞、每批重要实验，杀灭曲线都要重新跑——细胞状态、血清批次都会影响敏感度；
• MOI 摸索和杀灭曲线并行做，互不耽误；
• 如果整个稳转株项目外包，也建议确认服务方的流程里包含这两个预实验——有没有这一步，是判断服务是否专业的快速指标。吉凯的稳转株交付（混合克隆/单克隆、OE/RNAi/KO/KI）默认包含全部预实验，交付前完成 qPCR、WB、支原体检测，每株至少冻存 6 支、复苏复检合格后发货。

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总结

Puromycin 杀灭曲线的操作要点浓缩成五句：

野生型细胞、70% 密度、梯度加药、48h 判读、取最低全致死浓度。

三条经验：

• 筛选浓度和维持浓度是两回事：全死浓度用来筛，1/2~1/4 或更低用来养；
• 对照孔（野生型+药）是判读标尺：没有它，筛选成败无从判断；
• 这 3~5 天不能省：省下的时间一定会变成更长的返工。