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慢病毒感染细胞|为什么你的感染效率那么差?

发布时间:2019-10-29 13:12 |  点击次数:

慢病毒不但可感染分裂或非分裂细胞,还可将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而实现持久表达,又不易引发机体免疫反应,被誉为“细胞实验佳选、体内实验必备”的工具病毒。

 

并且慢病毒作为基因治疗载体在各类遗传性和后天性的人类疾病的治疗中倍受欢迎:从基础研究到临床应用,高纯度、高滴度的慢病毒都是基因操作的理想工具。

 

由于实验中使用的细胞类型不同,慢病毒感染的效率也会有差异;要想提高慢病毒的感染效率,合适的实验步骤和最佳的实验条件是成功的关键!

 

以“24孔培养板、贴壁细胞”为例,慢病毒感染细胞的常规操作步骤是这样的:

Day 0

接种细胞:

每孔按5×个待感染细胞铺板,用含有 10% FBS的DMEM培养基培养;

Day 1

细胞感染:

感染前,根据说明书用完全培养基配置感染液,备用吸掉旧培养基,更换为感染液; 并参考细胞 MOI值,计算病毒使用量,加入病毒进行感染,混匀;

Day 2

病毒感染8-16h后,换回常规培养基,继续培养;

Day 3-4

确认感染效果:

感染72h后,显微镜下观察感染效果,如EGFP、Cherry的表达情况;

 

如果你以为所有的细胞操作都这么简单的话,那真的是too young too simple!

 

那么在慢病毒感染细胞过程中,到底会遇到哪些问题呢?

 

在细胞感染时, MOI是一个非常重要的指标,如何确定MOI值呢?
 

MOI:复感染指数,是指病毒对细胞的感染能力,MOI越高,细胞越难被感染。通常把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。

MOI=(病毒滴度×病毒体积)/细胞数目

 

感染条件及MOI的选择原则:

 

1. 在细胞形态不受影响的情况下尽可能用少的病毒感染细胞

 

2. 选择感染效率80%左右的作为最佳感染条件

 

通过细胞感染预实验可以知道慢病毒对细胞的最佳感染条件,来确定细胞的MOI,进行正式实验。

 

由于不同实验室细胞代数、状态等因素,MOI值存在一定差异。吉凯基因已对常见细胞的MOI和感染条件进行了汇总,在吉凯基因公众号后台回复“MOI”即可查看!

 

 

如何解决细胞难感染的问题?

 

慢病毒对细胞的感染效率受多个因素影响,如细胞自身生长的状态,细胞数量,细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖,轮廓清晰,合适的细胞密度,选择最优的感染条件可以更好的保证感染效率。

 

对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,可以通过添加病毒感染增强液来显著提高转染效率。

 

吉凯基因自主研发了HitransG A和HitransG P 2款感染增强液,可显著提供难感染细胞的感染效率。详细看一下这2款增强液的原理和适用范围。


以下是使用吉凯基因包装的慢病毒配合增强液HitransG在难感染细胞中的效果图,是不是以后再也不担心细胞难感染的问题。



 

此外,对于悬浮细胞,可采用离心感染方法,减少病毒感染时的体积,从而进一步提高感染效率。如将细胞培养板密封后,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养。

 

除了难感染外,加入慢病毒后,细胞死亡也是科研的又一拦路虎。

 

加入慢病毒后,细胞死亡很厉害,该如何处理?

 

慢病毒中的杂质是造成细胞毒性的主要因素。

 

小编在这儿提醒大家:“一定根据自己的实验需求,选择合适纯度的慢病毒!”

 

吉凯基因 专业病毒包装17年,年产上万次病毒产品;并且通过独特的分级纯化工艺,可提供A级、B级和C级3种不同纯度级别的慢病毒产品,满足不同实验需求。

 

如果不幸,遇到了细胞死亡的情况!怎么办?

 

吉凯给您来支招:

 

调整并降低感染的MOI值,并且在感染后4小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察;若发现细胞状态变差时,则需要立刻对细胞进行换液操作,使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

 

如果这些技能您都掌握了,那么恭喜您离Nature、Cell、Science又近了一步~~

 

我们一起来看看2018年那些用了吉凯基因慢病毒产品的科研大咖都发表了什么样的文章吧!

 

【1】瑞金医院高血压研究所:A2A Receptor Activation Attenuates Hypertensive Cardiac Remodeling via Promoting Brown Adipose Tissue-Derived FGF21,Cell Metabolism(IF20.565)

吉凯产品:干扰慢病毒;

 

【2】北京安贞医院:Cardiac Fibroblast-Specific Activating Transcription Factor 3 Protects Against Heart Failure by Suppressing MAP2K3-p38 Signaling,Circulation 

(IF 18.881)

吉凯产品:干扰慢病毒、过表达腺病毒等;

 

【3】南方医科大学: Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway, SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE (IF 16.71)

吉凯产品:CRISPR-Cas9敲除慢病毒

 

【4】山东大学附属省立医院:Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol,Cell Research (IF 15.393)

吉凯产品:干扰慢病毒、过表达腺病毒等;

 

【5】重庆医科大学第二附属医院:CD36 palmitoylation disrupts free fatty acid metabolism and promotes tissue inflammation in non-alcoholic steatohepatitis,Journal of hepatology(IF 15.04)

吉凯产品:慢病毒;

 

【6】浙江大学医学院附属第二医院:EphrinB2 Regulates Cardiac Fibrosis Through Modulating the Interaction of Stat3 and TGF-β/Smad3 Signaling,Circulation Research (IF 15.211)

吉凯产品:干扰慢病毒;

 

 【7】中国科学院神经科学研究所:PDGFRβ cells rapidly relay inflammatory signal from the circulatory system to neurons via chemokine CCL2,Neuron(IF 14.319)

吉凯产品:干扰慢病毒;

 

【8】海军军医大学东方肝胆外科医院:Distinct Role of Nuclear Receptor Corepressor 1 Regulated de novo Fatty Acids Synthesis in Liver Regeneration and Hepatocarcinogenesis,Hepatology  (IF 14.079) 

吉凯产品:干扰慢病毒;

 

【9】南京大学:Regularizing firing patterns of rat subthalamic neurons ameliorates parkinsonian motor deficits,The Journal of Clinical Investigation (IF 13.251)

吉凯产品:干扰慢病毒;

 

 【10】中山大学附属第一医院:Long noncoding RNA LERFS negatively regulates rheumatoid synovial aggression and proliferation ,The Journal of Clinical Investigation (IF 13.251)

吉凯产品:过表达慢病毒;

 

【11】香港中文大学:A newly identified lncRNA MAR1 acts as a miR‐487b sponge to promote skeletal muscle differentiation and regeneration,Journal of cachexia, sarcopenia and muscle (IF 12.511)

吉凯产品:干扰慢病毒;

 

【12】首都医科大学:Mandible exosomal ssc-mir-133b regulates tooth development in miniature swine via endogenous apoptosis,Bone research(IF 12.354)

吉凯产品:上调和下调慢病毒

 

【13】海军军医大学东方肝胆外科医院:Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer,Nature Communications(IF 12.353)

吉凯产品:慢病毒

 

【14】温州医科大学药学院: Maresin 1 improves the Treg/Th17 imbalance in rheumatoid arthritis through miR-21, Annals of the rheumatic diseases (IF 12.35)

吉凯产品:慢病毒

 

【15】厦门大学:RPS23RG1 Is Required for Synaptic Integrity and Rescues Alzheimer's Disease–Associated Cognitive Deficits,Biological Psychiatry(IF 11.984)

吉凯产品:慢病毒

 

【16】南京大学:Orexin prevents depressive-like behavior by promoting stress resilience,Molecular Psychiatry(IF 11.640)

吉凯产品:干扰慢病毒;