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诺奖级技术「光遗传学」——更快、更精、更便捷操控细胞

人阅读发布时间：2019-11-04 15:06

光遗传学（optogenetics）是一项结合了光学和遗传学的技术，其原理是光敏蛋白在特定波长光照的刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，如 Cl^-、Na⁺、H⁺、K⁺，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。其调控精度很高，在时间上最快可以实现亚毫秒级的调控，在细胞上可以精细到单细胞水平上的调控。光遗传技术应用中主要有三部分组成：光敏蛋白、光敏蛋白表达递送、光的递送。目前光遗传学技术正朝着光敏蛋白反应更快、表达更精准、光的递送更方便的方向高速发展。

一、光敏蛋白选择

光敏蛋白根据其功能可分为兴奋性光敏蛋白和抑制性光敏蛋白。兴奋性光敏蛋白基本都是由光敏感通道蛋白（Channelrhodopsins，ChRs）为基础开发而来，ChRs 为经典的非特异性阳离子通道，在蓝光刺激后使神经元去极化。抑制性光敏蛋白则基本以盐细菌视紫红质（Halorhodopsins，HR）、菌视紫红质（Bacteriorhodopsins，BR）等为基础改造而来，HR 为氯离子通道，黄光刺激后氯离子内流使细胞超极化，BR 为质子泵，绿光刺激后质子外流使细胞超极化（图1）。

图 1. 常用光敏蛋白

以往光遗传技术应用中一般选择光敏感蛋白 ChR2（兴奋）和 eNpHR3.0（抑制），但是随着新的改造型光敏蛋白的不断问世，我们在光敏蛋白的使用上有了更多的选择（表 1）。ReaChR、Jaws 等能透过皮毛、头骨等激活深层组织细胞，具有很大的临床应用潜力；soCoChR、Chronos、FLInChR 等时间精度达到 1 毫秒以内，细胞精度可实现对单个细胞的操控，有效避免了其它干扰因素使得实验结果准确度大大提高，尤其在研究神经环路对行为学影响时；ChR2-SFOs、VChR1-SFOs 等双稳态光敏蛋白可以精确控制光遗传元件作用时间；stGtACR1/2 由 GtACR1/2 改造而来，实现了胞体膜表达特异性并解决了轴突、树突干扰的问题。

表 1. 常用光敏蛋白列表

二、光敏蛋白表达递送

与 GFP 的遗传编辑类似，在特定细胞中表达光敏蛋白可通过病毒注射或转基因动物等方法实现。因为转基因动物操作复杂、周期长且成本高，目前体内神经元表达光敏蛋白主要采用病毒载体注射的方式，多用安全高效的腺相关病毒 AAV（图 2），此外包装容量大且可跨多级突出传递的 HSV 等嗜神经病毒也逐渐用于光敏蛋白递送。一般通过特异性启动子实现光敏蛋白的细胞特异性表达，具体选择可以参考吉凯基因的神经系统 AAV 血清型及特异性启动子选择指南。

图 2. AAV 有效递送光敏蛋白在神经元中表达

由于光敏蛋白需要在细胞内有足够的表达水平才能发挥调控作用，因此那些特异性启动子转录活性弱的细胞在应用光遗传操控时就面临很大的问题。对于此类问题我们可以利用 Cre-loxp 系统解决，如图 3 构建带有 loxp 开关的 AAV 载体注射到细胞特异性表达 cre 的小鼠中，由于 cre 重组酶活性高，使其目的基因序列反转进而在强启动子的作用下高水平表达。

图 3. Cre 依赖的高表达载体

吉凯基因具有多种光遗传元件 AAV 现货，详见文末产品列表。此外还提供特殊光遗传 AAV 定制服务，满足客户各种实验需求。

三、光的递送

在光遗传技术中，要实现对细胞的控制就要保证光能够照射到相应表达光敏蛋白的细胞，因此光的递送至关重要。在体外实验中，我们可以把激光或 LED 利用显微镜的微光路直接照射靶细胞而激活光敏蛋白。但在体内实验中，光递送方法的发展制约着光遗传技术的应用。目前常用的递送方式是通过轻量的柔性光纤传递光信号或者利用双光子给予特定脑区光刺激。但这些信号递送方式均需要在动物头部连接光纤，一定程度上限制了动物的自由活动，影响行为学方面的研究。无线光极的发明则很好的克服了这个问题（图 4）。