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公司新闻/正文
miRNA 下调新方法：教你如何摆脱 QPCR 检测无效
3197 人阅读发布时间：2020-11-18 13:20
miRNA 作为热门的小 RNA 分子，已经在科研圈火了很多年，尤其是 lncRNA、circRNA 的海绵机制被发现后，作为 ceRNA 的核心，又变得炙手可热。基于 miRNA 的功能缺失手段也较为成熟，但是不少实验者反馈：「做 miRNA 下调，QPCR 检测 miRNA，表达水平无变化」，这到底是怎么回事、以及如何解决呢？
一、miRNA 抑制为啥
QPCR 检测无效？
现有 miRNA 抑制手段，无论是基于载体构建的、还是化学合成的，本质上都是用跟成熟体互补的反义 miRNA（miRNA 海绵体属于不完全互补的反义 RNA 重复），其可以通过结合 miRNA，阻断其与靶基因结合，但并不能有效引发 miRNA 的降解，原因有两方面：其一是反义 RNA 与 miRNA 结合后，序列很短，导致 Dicer 酶（细胞内降解双链 RNA 的主角）不能有效结合；其二是 miRNA 与 Ago2 以 RISC 复合物的形式存在，该复合物也会导致 Dicer 酶无法高效结合。
首先，我们看下《RNA Biology》上一篇文章对于 miRNA 反义核酸的描述1：
首先，我们看下《RNA Biology》上一篇文章对于 miRNA 反义核酸的描述1：
翻译一下：
因此，如果以反义 RNA 技术抑制 miRNA 功能，QPCR 可以做，如果检测出表达水平下降还好，即便未检测到，也不表示抑制无效，正确的做法是直接检测目的基因蛋白水平是否有上调。但若实验者不清楚靶基因的情况下，不检测到 miRNA 下调，心里是没底的，如何解决呢？？？
反义核酸是在转录后水平发挥功能，要阻断 miRNA 的产生，理想情况是在生成成熟的 miRNA 之前阻断。此要求目前唯有 CRISPR / Cas9 能实现，Cas9 通过在 pre-miRNA 序列中引入突变，从而破坏 miRNA 表达，是 miRNA 基因功能缺失研究的一种新方法。
反义核酸是在转录后水平发挥功能，要阻断 miRNA 的产生，理想情况是在生成成熟的 miRNA 之前阻断。此要求目前唯有 CRISPR / Cas9 能实现，Cas9 通过在 pre-miRNA 序列中引入突变，从而破坏 miRNA 表达，是 miRNA 基因功能缺失研究的一种新方法。
二、CRISPR / Cas9 敲除
miRNA 案例
CRISPR / Cas9 能实现miRNA 的敲除吗?技术会被认可吗？
首先，列举两篇运用吉凯基因 Cas9 病毒实现 miRNA-KO 的文章：
福建肖老师运用 Cas9 技术，针对 miR-21 基因设计 sgRNA ，通过慢病毒递送细胞，并在 RNA 水平检测到 mir-21 的下调表达，从而研究出 miR-21 耗竭对 CNE2 鼻咽癌（NPC）细胞生物学特性及其潜在机制的影响2。
使用 Cas9 敲除 miR-21 之后，功能上也呈现出阳性：
此外，温医大第一医院的张老师使用 Cas9 敲除 mir-545，研究了人环状 RNA PRKCI（circPRKCI）通过抑制 miR-545 显示致癌性，促进人类神经胶质瘤细胞的病理进展3。
所以，CRISPR / Cas9 对于 miRNA 的 KO 是有效的、被认可的、且以 QPCR 检测表达量完全没有问题，那该技术内在的机制是怎样的呢？
三、CRISPR / Cas9 敲除
miRNA 的分子机制
首先，从 miRNA 形成机制谈起，前体 pri-miRNA 由基因组转录，该前体一般长约几 KB 至几十 KB 不等，每个 miRNA 的 pri 长度都不一样，pri 在细胞核进行第一次剪切形成 pre 前体，pre 一般长约 70-120bp，含有类似于 shRNA 的颈环结构，pre 随后转运至细胞质，在 Dicer 酶的剪切下变为成熟体。
miRNA 成熟过程
针对 pre 前体序列设计 Cas9 靶点，将 DNA 打断后，依靠非同源末端连接（NHEJ) 效应，在 pre 的成熟体或者颈环上引入突变碱基或者缺失，从而破坏颈环整体结构，引发 pre 剪切受阻，从而抑制了成熟体的产生。实验证明，靶点位于颈环或者臂都能有效抑制 Dicer 酶剪切4：
综上所述，Cas9 技术为 piRNA、miRNA 这类小 RNA 分子的抑制提供了除反义核酸之外的另一种选择，并能有效解决 QPCR 检测不稳定的难题。吉凯基因常规针对 pre-miRNA 设计两个 Cas9 靶点定制，80% 的情况下能实现至少一个靶点对 miRNA 的有效 KO，还在等什么，快来咨询吧！！！
吉凯基因，年产上万次慢病毒、腺病毒、腺相关病毒；
建有国内大型的慢病毒文库，包含几乎覆盖人类所有基因的，近 15 万个独立克隆；
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18 年品质保证、助力客户发表 10000+ 篇 SCI，多项科研成果发表于 Nature Medicine、Nature Immunology、Gastroenterology、Cell Metabolism、Nature Neuroscience 等著名期刊上
【参考文献】
1. Anti-miRNA oligonucleotides: A comprehensive guide for design.
2. MicroRNA-21 depletion by CRISPR/Cas9 in CNE2 nasopharyngeal cells hinders proliferation and induces apoptosis by targeting the PI3K/AKT/MOTOR signaling pathway.
3. Circular RNA PRKCI promotes glioma cell progression by inhibiting microRNA-545.
4.Lentiviral CRISPR/Cas9 vector mediated miR-21 gene editing inhibits the epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer cells.