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公司新闻/正文
从质粒到病毒——基因过表达的那些事儿
9217 人阅读发布时间：2020-11-18 13:45
通过质粒或者病毒构建目的基因的CDS（Coding sequence）区域DNA序列，然后将其导入实验细胞，是最重要的基因表达调控方式之一。
如果经常做这方面的实验，可能对于上述方法已经习以为常。但是，如果是才开始接触的新人，可能还会问：为什么只构建CDS区域？我在NCBI上查这个基因的mRNA序列比CDS要多出很多。这里有一个重要的考虑，因为我们只需要构建CDS区就能表达出目的蛋白，而一个成熟的mRNA通常还会包含很长的非编码区，这些区域如果也构建的话，会导致成本大量增加，同时也将提高质粒构建的难度，降低病毒包装的容量。这里提到的非编码区主要有两个部分，一个是5’UTR（Untranslated Regions），在CDS上游；一个是3’UTR，在CDS下游（图1）。
图1. 典型的编码基因构成
除去构建方面的考虑，还有一个因素也是促使我们截去UTR的重要原因。一般过表达质粒或者病毒的构建都是为了在目的细胞中过表达某个基因，但是很多基因的表达是受到细胞内稳态调节的，因此在非异常状态下，对于一些单个基因，如果其表达升高，细胞会倾向于下调其表达，如果是表达降低，细胞会倾向于上调其表达，而这种内稳态的维持包括mRNA水平的调控和蛋白水平的调控。这两个调控过程很大程度上是通过UTR上的各种顺式调控元件来完成的。
以3’UTR为例，很多基因的3’UTR上有miRNA结合位点，在结合miRNA之后将抑制mRNA的翻译过程（图2）。再举一个例子，BDNF至少有10个转录本，这些转录本差异仅在5’UTR，其后所有编码的外显子序列完全相同（翻译后蛋白相同），正是由于不同的5’UTR，这些BDNF的转录本被发现在不同的细胞中显示出不同的功能，这暗示了5’UTR可能影响了不同转录本在各种细胞中的稳定性或者剪接方式。因此，如果外源过表达基因同时构建了CDS和UTR，细胞内源的一些反式作用因子和外源mRNA的UTR上的顺式作用元件相互作用，很可能会降低外源mRNA的稳定性，抑制其蛋白翻译过程。也正是由于UTR参与表达调控的复杂性及多样性，如果不是为了研究这些UTR的功能，仅仅为了研究某个蛋白过表达的影响，只构建CDS无疑是一个最优的选择。
图2. miRNA通过结合3’UTR抑制翻译的可能模式
对于UTR的功能的认识，又给了我们一些其他方面的有趣的启示：特定的UTR能够降低mRNA稳定性，抑制蛋白的翻译过程，是否对于另外一些UTR有相反的作用呢？
我们先简单回顾一下真核细胞翻译起始过程。真核细胞的翻译过程始于43S预起始复合物（preinitiation conplex，PIC）的组装，该复合物包含甲硫氨酸起始子tRNA（Met-tRNAi），GTP和eIF2。在完成组装后，在帽结合蛋白eIF4E, eIF4G和RNA解旋酶eIF4A以及poly(A)结合蛋白PABP的协助下，43S PIC结合到mRNA的5’帽子。随后PIC从5’端帽子开始往下游扫描，通过Met-tRNAi识别一个AUG。AUG识别引起与eIF2结合的GTP水解，从而产生稳定的48S PIC。随后eIF2-GDP被释放，在eIF5B的催化下，60S核糖体亚基开始结合进来，最终产生80S起始复合物，开始蛋白翻译合成过程。
从真核细胞翻译起始过程看，在识别到AUG之前，43S PIC要扫描通过5’UTR。虽然已有研究表明，如果在5‘UTR存在一个阅读框（上游阅读框，uORF），将有可能抑制下游编码基因阅读框（mORF）的翻译。这种抑制主要有两种机制，一是这个阅读框存在终止密码子，导致80S复合物从mRNA上脱离；二是80S复合物在uORF上完成翻译后后没有解体，保持结合，抑制PIC向下扫描到下游编码基因阅读框的AUG（图3）。但是，如果有某段序列，能够提高43S PIC扫描稳定性和准确性，以及起始翻译的效率，将这段序列构建到CDS前模拟5’UTR很可能能够极大提高蛋白的翻译效率，提升蛋白过表达效果。在酵母中的一份研究表明，同一个基因，不同转录本，仅有5’UTR有差异，其翻译效率差异大于100倍。这就表明这种提高翻译效率的5’UTR很可能是存在的，当然也有另外一种可能性，是翻译效率更低转录本的5’UTR具有抑制翻译过程的作用。然而，在酵母中的研究还发现，带有更短5’UTR的mRNA其翻译效率要低于整体平均水平，这就给了我们更多的遐想。
图3. 5’UTR上的uORF抑制下游编码基因
阅读框翻译（mORF）
我们再看看3’UTR的作用，3’UTR 的序列长度在一个很大的范围，短的可能100bp左右，长的很多甚至超过20000bp。3’UTR拥有许多顺式调控元件，包括腺苷酸-尿苷酸富集序列元件（AU-rich element），RNA结合蛋白结合位点（PUF，hnRNPs等），miRNA结合位点等。这些顺式调控元件可能和一些反式作用因子结合，调控mRNA的稳定性和翻译过程。
考虑到mRNA的3’UTR和miRNA结合，主要是抑制蛋白的翻译过程，因此，我们目前猜测，基因本身3’UTR的去除对于外源蛋白翻译的影响较小，但是不排除特定的3’UTR具有能够影响mRNA稳定性的可能性和其本身参与了mRNA二级结构形成的可能性。
综上，对于基因的过表达构建方式的选择，我们建议只用构建CDS区域。但是我们猜测可能在一些UTR中存在某些特殊的序列能促进蛋白的翻译过程或者提高mRNA的稳定性，而我们吉凯基因也正在寻找这类序列以进一步完善我们的产品，提高使用人员的体验度。
当然，实际的mRNA的转录和翻译过程非常复杂，今天提出上述的针对基因过表达调控的猜测仅供大家参考，也有抛砖引玉之意，希望为大家无论是思考这个问题还是解决这个问题开拓思路。
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【参考文献】
1. Hinnebusch AG, Ivanov IP, Sonenberg N.（2016）. Translational control by 5′-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science. 352(6292):1413-6.
2. Guramrit Singh, Gabriel Pratt, Gene W. Yeo. (2015). The Clothes Make the mRNA: Past and Present Trends in mRNP Fashion. Annu Rev Biochem. 84:325-54.