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公司新闻/正文
干货| 增强子SNP预测、实验操作指南
2833 人阅读发布时间：2020-11-18 13:42
随着分子生物技术的发展，全基因组关联研究（GWAS）已成功鉴定出与复杂疾病或其他表型性状显著相关的众多遗传变异，以单个核苷酸变异为主，简称SNP。有趣的是，许多变异位于基因组的非编码区。这些非编码DNA突变体在分子水平上是否以及如何影响表型性状，在很大程度上仍然未知，那么如何研究呢？小编将用多篇文章分别阐述SNP位于增强子、剪切位点、UTR位置的研究思路，今天谈谈增强子。
SNP位于编码区会直接导致蛋白氨基酸组成发生变化，从而诱发结构或者功能的改变，研究相对容易，只需分别过表达野生型、突变型基因，分析表型；但远离基因座或者位于内含子中的SNP不会对蛋白组成及结构造成变化， 是否有功能呢？往哪个方向研究呢？
我们来看一些案例：
转录因子HLTF、LEF1和MITF通过调节位于色素基因OCA2上游21 kb 的rs12913832，影响OCA2基因表达强度，从而调节人皮肤、眼睛和头发的色素性状[1]；
转录因子AP-2α结合IRF6内含子中的rs642961位点，其变异型与唇裂症发生有关[2]；
HOTAIR内含子中的rs920778位点与食管鳞状细胞癌有关[3]；
通常坐落于增强子内的非编码性SNP，有两种情况：
一、真正的增强子，不依赖于调控蛋白即可影响基因表达，这类研究也比较容易，直接构建包含SNP的一段增强子序列即可；
二、影响转录因子调控，即SNP的不同亚型与转录因子的结合强度不同，造成调控活性的变化，此处的难点为如何预测得到对应的转录因子。
下面小编就以rs10036653（rs+数字为SNP位点的标准命名）位点为例，给大家演示下。
“upstream”意味着位点位于ATG10基因的转录起始位点上游，那么如何预测与之相关的转录因子呢？
一、网站预测
在主页输入框填入“rs10036653”，点击“提交/search”，可见snp的多参数信息，按照下图展开：
Haploreg搜索结果
Regulomedb搜索结果
即可得到预测的差异化motifs（motifs：即转录因子结合模型，也就是转录因子）：
Haploreg预测的差异motifs
Regulomedb预测的差异motifs
通过两个网站分析出与rs10036653相关的转录因子有GFI1、POU5F1、SOX5、IRF1、P300。
二、序列预测
若SNP通过测序得出，无rs编号，或者上述网站未预测到转录因子，可借助转录因子预测网站TFbind分析不同亚型的序列，然后找出差异的转录因子。转录因子与DNA的结合长度一般为5-20bp，因此在snp位点两端各延伸30bp预测即可：
Ref: CTTTTAGTTTCTTTGTTTTTGGCATGTGAATTATGAAACTTTAAAACACCTCCAGTGCA
Alt: CTTTTAGTTTCTTTGTTTTTGGCATGTGATTTATGAAACTTTAAAACACCTCCAGTGCA
输入网站预测（fasta格式）：
TFbind输入序列
将预测结果导入excel，删除冗余项（导出数据需分列），然后手动对比评分有差异、或者转录因子ID差异的并且标出，即可得到与snp不同亚型结合的转录因子：
数据整理及对比
这三个方便易用的网站可满足大部分SNP的分析，预测了转录因子，接下来如何做验证呢？
三、CHIP
CHIP：通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，富集与本底或者外源表达转录因子结合的DNA，通过qpcr验证转录因子与不同SNP亚型的结合强度。
多个转录因子与不同SNP亚型的结合强度（CHIP-qpcr）[1]
四、EMSA
EMSA: 凝胶电泳迁移实验，将探针标记DNA片段与细胞裂解液孵育，以电泳迁移率的变化进行定性和定量分析。只需将不同SNP亚型的片段标记探针，与细胞液孵育，以电泳迁移率分析蛋白与片段是否结合。
rs642961亚型与AP-2α的EMSA实验[2]
五、荧光素酶报告实验
研究基因间调控活性，常做的就是荧光素酶报告系统。通过构建报告系统研究SNP位点的增强子与转录因子是否结合最为直接，根据SNP位置不同，不同文章构建方法也是不一样的，具体如下：
1.SNP位于启动子区域（一般5k以内）：直接构建启动子全长至PGL3 basic[4]。
2.SNP位于启动子上游远端：构建SNP位置1k左右的序列与目的基因启动子联合构建至PGL3 basic[2]。
3.SNP位于基因内含子或者基因下游：构建SNP位置1k左右的序列至PGL3 promoter的luc下游，也可将载体本身SV40启动子替换为目的基因启动子[5]。
以上就是增强子SNP的预测及实验操作指南，简单易学。吉凯基因拥有全套荧光素酶报告载体既转录因子过表达现货，可助您快速完成实验所需质粒，快来咨询吧！！！
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【参考文献】
[1] HERC2 rs12913832 modulates human pigmentation by attenuating chromatin-loop formation between a long-range enhancer and the OCA2 promoter
[2] Disruption of an AP-2α binding site in an IRF6 enhancer is strongly associated with cleft lip
[3] The identification of an ESCC susceptibility SNP rs920778 that regulates the expression of lncRNA HOTAIR via a novel intronic enhancer
[4] Single nucleotide polymorphism- and cell type-dependent gene expression of neuropeptide Y2 receptor
[5] Promoter and intronic variants affect the transcriptional regulation of the human dopamine transporter gene