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公司新闻/正文
基因治疗新手段——工程化外泌体
4570 人阅读发布时间：2020-11-18 13:26
在过去的几十年中，多种药物递送系统（DDS）进入了临床实验，例如脂质体，合成纳米颗粒。然而，由于效率低、细胞毒性、免疫原性、无法跨越血脑屏障等原因，此类系统的应用受到限制。同时，天然药物载体系统领域发展迅速，例如外泌体。外泌体（exosome）是直径40-120nm的细胞外囊泡（EVs），介导细胞内物质的细胞间转移（如miRNA、mRNA、蛋白质等），并且是用于治疗性递送双分子货物（例如核酸，蛋白质甚至药物）的有吸引力的载体，其内源性和生物学特性均优于常规递送手段。
早前，已有研究显示，外泌体用于治疗手段是可行的，如间充质干细胞（MSC）的分泌物可改善心肌梗塞/再灌注损伤并减少梗塞面积1；外泌体介导抗原呈递并激活自然杀伤细胞以诱导抗肿瘤反应2；树突状细胞衍生的外泌体对转移性黑素瘤的治疗已进入临床实验3。但未修饰的exosome潜在的脱靶性限制了其临床应用，需要开发具有靶向性的exosome。
工程化的EXO开发策略应运而生：基于LAMP2（一种膜蛋白，广泛存在于外泌体）定位EXO的特性，将特定细胞靶向的多肽融合至LAMP2的N末端，可实现exosome的定向递送。该策略与AAV外壳蛋白插入靶向肽异曲同工4，并且某些靶向肽还可以共用，如神经元乙酰胆碱受体特异性的肽RVG。
今天小编精简一篇文章为你讲述工程化EXO用作DDS的技术流程：
5-氟尿嘧啶（5-FU）常用于大肠癌（CRC）的治疗，miR-21i（miR-21抑制剂寡核苷酸）可降低对5-FU的耐药性，因此，作者利用工程化改造的exosome向直肠癌细胞HCT-116递送5-FU及miR-21i。将靶向Her2（一种与肿瘤发生、发展的基因）的多肽融合至LAMP2的N末端，并融合绿色荧光GFP，简称为THLG5。
工程化EXO技术路线
步骤一
由于外泌体是从不同的细胞类型产生的，因此亲代细胞来源需要进行研究。在选择不同的外泌体分泌细胞时需选择预期用途的亲本细胞，如来自专业抗原递程细胞如树突状细胞、B细胞、巨噬细胞的外泌体，诱导Th1型免疫应答，来自干细胞分泌的外泌体广泛用于组织修复。
作者第一步构建表达THLG的293细胞，并以荧光、WB确认基因的表达，以滤膜过滤细胞分离出exosome，以共聚焦、电镜等手段确认了THLG在exosome的表达。
步骤二
使用电穿孔技术将需要搭载的药物、寡核酸等物质导入exosome，调整参数时间10 ms，电压为1000 V时，可获得最大的负载效率。可用HPLC或者qPCR 检测exosome的负载量。
步骤三（细胞验证）
将THLG-EXO与对照EXO和人结肠癌细胞HCT-116共孵育，以流式及增殖实验分析，显示THLG-EXO体外抗肿瘤作用明显。
步骤四（体内验证）
尾静脉注射exosome至HCT-116细胞感染的裸鼠，LG-EXO为对照，体内成像系统显示，注射后的半小时，外泌体迅速扩散全身，3h后，THLG-EXO主要集中癌细胞，而对照集中在肝脏；6h后，大部分EXO被清除，THLG-EXO仅在癌细胞中剩余，但对照在颈，四肢分布。该结果显示出THLG较好的大肠癌靶向性。
以荧光素酶标记HCT-116细胞感染的裸鼠，结果显示，与对照组相比，THLG-EXO有效抑制了肿瘤细胞在体内的增殖；处死小鼠，肿瘤称重，也显示出相同的结果。
毒性评估
作者对小鼠注射THLG-EXO与PBS，并于一周后分析血液多参数生化分析，包括对心、肝、脾、肺和肾脏在内的主要器官进行组织病理学检测，表明THLG-EXO未显示出炎症反应及其他毒副作用。
以上就是工程化exosome设计及实验验证的全流程，另一篇文章中，将神经元特异性RVG展示在外泌体，并装载外源性siRNA，以静脉递送的方式，敲减大脑中BACE1基因，用于治疗阿尔兹海默症6。开发用于扩散递送至大脑的基因治疗载体是临床基因治疗应用的重大挑战，传统药物很难跨越生物屏障（例如血脑屏障），而exosome则没有该限制7, 并且用自身来源细胞分泌的外泌体，装载外源物回输患者体内，也避免了免疫排斥反应。
尽管exosome介导的体内基因传递没有明显的副作用，但仍需要进一步检查从亲本细胞掺入外来体（核酸和蛋白质等）对受体细胞的影响；此外，外泌体用于多组分递送的生物学参数和治疗潜力仍需要进一步研究，才能转化为临床应用。总之，外泌体的发现及其作为潜在治疗传递系统可能为基因治疗领域带来巨大飞跃，为治疗药物的递送提供了有前景的运载手段。
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【参考文献】
1. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.
2. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.
3. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst Phase I clinical trial.
4. Hepatocellular carcinoma cell-specific peptide ligand for targeted drug delivery.
5. Engineered exosomes for targeted co-delivery of miR-21 inhibitor and chemotherapeutics to reverse drug resistance in colon cancer.
6. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes SiRNA.
7. Exosomes and the blood–brain barrier: implications for neurological diseases.