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单细胞测序样本制备——皮肤组织篇
人阅读 发布时间：2022-12-01 17:16
皮肤覆盖全身，是人体最大的器官，包裹身体的最外层并时刻参与机体的功能活动，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭，具备屏障作用、感觉作用、调节体温、吸收作用、分泌和排泄作用等生理保护功能。同时，机体的许多异常情况会在皮肤表面反映出来，这也是造成皮肤科疾病种类庞杂的原因之一。单细胞测序可以帮助研究者们在分子和细胞水平上进一步探索皮肤疾病的发生和发展进程，为临床诊疗提供更多参考。
皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分组成，表皮包含角质形成细胞、Langerhans cell、黑色素细胞等，真皮层富含胶原纤维、网状纤维、弹力纤维和透明质酸等，皮下组织则由疏松的结缔组织和大量脂肪组织组成。
针对皮肤组织的构成特点，我们采用DNase I和其他类型胶原酶配置特定的混合酶液对组织进行解离，消化前后结合GentleMacs仪器进行研磨，通过机械辅助降低角质层细胞比例；皮肤样本细胞悬液制备中容易出现结团率偏高的情况，我们利用结团细胞团和单个细胞间沉降系数差进行离心沉降，辅助解离，降低结团率；对于碎片较多的样本，可通过活细胞染色流式分选来去除碎片和死细胞，获得总数多、活性好、碎片少、成团率低的单细胞悬液；同时，我们还可根据客户的具体需求，针对皮肤组织的特定类型细胞进行分选。
皮肤组织单细胞悬液制备
实验目的
客户提供新鲜组织样本（组织保护液保存），制备细胞悬液后用于单细胞测序。
实验准备
样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，准备好相应酶液。
【酶液】：
1 mg/ml Collagenase IV
3.5 mg/ml Collagenase II
0.04 mg/ml DNase I
0.002 mg/ml hyaluronidase
HBSS
实验步骤
1. 将组织放入培养皿中，放置在冰板上，加入清洗液，清洗三次；
2. 完全弃去清洗液后，加入少量配制好的酶液，使用干净的剪刀将组织完全剪碎；
3.待组织完全剪碎后，用移液器将每组剪碎的组织移到15mL离心管内，加入足量酶液混匀，取20µl进行台盼蓝镜检；
4.将装有组织的离心管放置在37ºC摇床上消化60min；
5.待消化结束，将所有消化液转移至离心管，加入足量清洗液，将其通过100µm, 40µm滤网转移至离心管，300×g 离心5min；
6. 加入清洗液，300×g 离心5min；
7. 弃去上清，加入红细胞裂解液重悬裂解红细胞，裂解时间3min；
8. 加入清洗液终止裂解并清洗细胞，300×g 离心5min；
9. 弃上清,加入清洗液继续清洗一次后重悬，取20µl悬液进行质检；
10.将细胞加到37% percoll上，400×g，20min,升降速度为1，离心；
11.弃上清，使用清洗液重悬细胞，分别取20µl进行台盼蓝染色和AOPI计数。
部分实验结果展示
样本：小鼠皮肤组织
细胞活率：98.8%
活细胞浓度：3.6E+05/ml
结团率：4.37%
样本：人黑色素瘤
细胞活率：93.27%
活细胞浓度：2.98E+04/ml
结团率：12.47 %
针对皮肤组织的构成特点，我们采用DNase I和其他类型胶原酶配置特定的混合酶液对组织进行解离，消化前后结合GentleMacs仪器进行研磨，通过机械辅助降低角质层细胞比例；皮肤样本细胞悬液制备中容易出现结团率偏高的情况，我们利用结团细胞团和单个细胞间沉降系数差进行离心沉降，辅助解离，降低结团率；对于碎片较多的样本，可通过活细胞染色流式分选来去除碎片和死细胞，获得总数多、活性好、碎片少、成团率低的单细胞悬液；同时，我们还可根据客户的具体需求，针对皮肤组织的特定类型细胞进行分选。
皮肤组织单细胞悬液制备
实验目的
客户提供新鲜组织样本（组织保护液保存），制备细胞悬液后用于单细胞测序。
实验准备
样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，准备好相应酶液。
【酶液】：
1 mg/ml Collagenase IV
3.5 mg/ml Collagenase II
0.04 mg/ml DNase I
0.002 mg/ml hyaluronidase
HBSS
实验步骤
1. 将组织放入培养皿中，放置在冰板上，加入清洗液，清洗三次；
2. 完全弃去清洗液后，加入少量配制好的酶液，使用干净的剪刀将组织完全剪碎；
3.待组织完全剪碎后，用移液器将每组剪碎的组织移到15mL离心管内，加入足量酶液混匀，取20µl进行台盼蓝镜检；
4.将装有组织的离心管放置在37ºC摇床上消化60min；
5.待消化结束，将所有消化液转移至离心管，加入足量清洗液，将其通过100µm, 40µm滤网转移至离心管，300×g 离心5min；
6. 加入清洗液，300×g 离心5min；
7. 弃去上清，加入红细胞裂解液重悬裂解红细胞，裂解时间3min；
8. 加入清洗液终止裂解并清洗细胞，300×g 离心5min；
9. 弃上清,加入清洗液继续清洗一次后重悬，取20µl悬液进行质检；
10.将细胞加到37% percoll上，400×g，20min,升降速度为1，离心；
11.弃上清，使用清洗液重悬细胞，分别取20µl进行台盼蓝染色和AOPI计数。
部分实验结果展示
样本：小鼠皮肤组织
细胞活率：98.8%
活细胞浓度：3.6E+05/ml
结团率：4.37%
样本：人黑色素瘤
细胞活率：93.27%
活细胞浓度：2.98E+04/ml
结团率：12.47 %
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