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『当红炸子鸡』免疫检查点阻断疗法对免疫细胞有何影响？安德森癌症中心结合scRNA和scTCR揭示了AML 相关T细胞亚群的异质性
1141 人阅读发布时间：2022-12-02 10:33
急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)，是一种骨髓性白细胞异常增殖的血癌，是成年人最常见的急性白血病，其发病率随着人的年龄而增加。与通过T细胞活性异体干细胞移植对急性骨髓性白血病的治疗效果相比，检查点阻断疗法只能获得适度的反应，这可能是由T细胞表型和T细胞受体（TCR）重组造成的。2021年，Abbas等人对配对的单细胞RNA和TCR进行了分析，通过比较PD-1阻断治疗前后的转录组及TCR，揭示了适应性T细胞的可塑性和基因组改变决定了急性髓性白血病对PD-1阻断的反应。
健康和AML BM的细胞类型差异
作者对8个AML的22个（治疗前8个和治疗后14个）骨髓（bone marrow，BM)抽吸物进行了配对的scRNA和scTCR分析，并在NCT02397720上进行了基于ICB的治疗（图 1A）。AML BM（图 1D）和健康人群的BM（图 1C）相比，AML细胞远离健康细胞，形成了不同的簇。
来自8名患者的22个R/R AML BM 抽吸物中的 60,753个AML和52,641个肿瘤微环境 (TME) 细胞通过了质量评估，被纳入下游分析。使用 scRNAseq 鉴定的 AML 细胞比例与通过临床流式细胞术（r=0.87，p=1.5×10-7）和组织病理学（r=0.73，p=0.0001）测量的原始细胞比例密切相关（图 1F）。治疗前和治疗后的AML细胞按患者聚集（图 1G），而来自不同患者的TME聚集在一起并具有不同的分布（图 1H，I）。AML和TME细胞的聚集模式与其他显示肿瘤间异质性的癌症相似。
治疗后的TCR克隆型展现出可变性
TCR分析可以反映T细胞对检查点阻断疗法的反应。健康BM中只有7.2% (345/4742)的TCR 克隆型在2个或更多T细胞中共享，AML BM中这一值为 51%。克隆型大小（由表达相同TCR序列的细胞数量表示）在健康供体中为1至16个，而在AML中为1至1200个（图 2A），表明AML骨髓中有较高的克隆性。
治疗前，AML患者中贡献最丰富的克隆型的T细胞的频率有明显的变化。治疗后，4名患者（2名反应者和2名SD）扩增了他们最丰富的克隆型（图 2B）。相反，NR (3/3) 患者的最丰富的克隆型收缩（图 2B）。正如预期的那样，健康的 BM T细胞库几乎没有优势克隆（图 2B）。与治疗前（时间点A）相比，3名应答者的克隆性在治疗后（时间点B）有所增加，并持续存在（时间点C），除了PT3（应答者）最初有克隆性增加（时间点B），随后在形态学上AML进展之前，克隆性减少（时间点C）。3 名 NR 和1名SD患者在治疗后其TCR克隆性相对降低，而1名SD患者（PT7）的TCR 克隆性持续增加（图 2C）。
T细胞具有适应性和可变性。为研究处理后克隆型丰度的变化，作者比较了每个克隆型的频率并确定了处理后发生显著变化的频率（图 2D）。新克隆（在预处理时未检测到）占显著扩展克隆型的 43%（图 2D，E）。与临床反应的关联揭示了不同的克隆型变化模式。具体来说，大多数 (77%) 扩增的克隆出现在应答者 (77%) 和 SD 患者 (18%) 中，而在NR和SD患者中发现了大多数（70%）收缩的克隆（图 2F）。这些发现表明，TCR 库对治疗的反应能力是可变的，类似于在实体癌中看到的。
AML患者T细胞群的异质性
作者在22个BM样本中鉴定了25,798 个T细胞中的5种T细胞表型（图 3A）。两种常规CD4+和 CD8+细胞，治疗前分别占53%和35%，治疗后分别占 30.9%和37.4%，治疗前CD4:CD8比为 1.51，低于健康 BMs（1.88），治疗后进一步降至 0.82。3种非常规T细胞γδ 、MAIT和unconv T细胞，治疗前占 2.3%、2.1%和7% ，而治疗后为8.5%、14.4%和8.5%。因此，CD8+、γδ 和MAIT细胞的比例增加，而CD4+ 细胞的比例在所有患者的聚合治疗后减少（图 3A）。此外，5种T细胞表型在8名患者间以及在治疗的不同时间点上有明显的差异（图 3B）。这些发现揭示了患者之间和反应组之间的异质 T 细胞表型，并揭示了治疗后纵向发生的动态变化。
T细胞的亚分类揭示了不同的细胞表型
亚群分析表明，CD4+细胞聚集成CD4+初始和 CD4+效应子亚群，包括 FOXP3+ (Treg)、T 辅助 1 细胞(TH1)、TH17细胞和CD4+细胞毒性 (CTL) 细胞，一个集群无明显表达谱 (CD4NOS)（图 3D）。CD8+簇包括CD8+naïve、CD8+ STAT1、CD8+ GZMK和CD8+ CTL（图 3E）。
通过GSVA测量些细胞的细胞毒性和衰竭程度，CD4+和CD8+的衰竭分随着细胞毒性的增加而增加（图 3D，E）。治疗前，3名响应者的CD4+和CD8+细胞耗竭评分最低（图 3F）。治疗后，CD4+的衰竭评分无变化，而 CD8+ 的衰竭评分在 3 名反应者中显著增加（p < 0.001）（图 3G）。TCGA 队列中具有较高 GZMK表达的 AML 患者总体存活率较高，这表明GZMK升高的固有免疫可以改善 AML 的结果（图 3H）。
伪时间轨迹分析揭示了一个 CD8+连续体
人类有5个颗粒酶基因（GZMA、GZMB、GZMH、GZMM和GZMK），只有GZMA和GZMB的功能得到很好的描述。为了研究颗粒酶的表达是否能反映细胞状态，作者进行了伪时空轨迹分析，发现了一个CD8+连续体，其中CD8+ GZMK细胞是CD8+ naïve细胞和CD8+ CTL细胞的中介（图 4A，B）。GZMA 普遍在非初始 CD8+ 细胞中表达，GZMB 在假时间表达较晚的细胞毒性 T 细胞中表达，GZMK 在较早的假时间中表达显著（图 4C-E）。与 CD8+ CTL细胞相比，CD8+ GZMK细胞中细胞毒性基因GNLY表达水平降低（图 4F）。此外，GZMK与GZMB、GNLY、PRF1、GZMH和PRF1表达及细胞毒性评分负相关（图 4G）。
GZMK表达区分了PT1中的 MAIT亚群
MAIT 细胞的无偏聚类揭示了2种不同的表型（图 4I），且89.9% 的 MAIT 细胞是由具有独特临床过程的 PT1（响应者）贡献的（补充图 6A）。在 PT1 中，经过治疗，MAIT GZMK的比例从 11% 下降到 8.2%，然后是 5.5%；MAIT CTL从 8.2% 增加到22.2%到23.9%（图 4J）。与 CD8+ GZMK细胞相似，MAIT GZMK细胞富含 CD27、LTB、TCF7 和 EOMES（图 4K）。
TCR 克隆型的表型特征
T 细胞中，细胞毒性亚型有更高的克隆型优势（图 5A）。CD8+ GZMK和CD8+ CTL对新克隆的贡献最大，而MAIT CTL的扩增克隆型比例最高，CD8+ CTL具有最高比例的收缩克隆（图 5B）。3 种最丰富的克隆型主要由具有相同或相似表型的细胞类型贡献，例如，CD8+ GZMK和CD8+ CTL为PT2、PT4、PT7和PT8贡献了最丰富的克隆（图5C）。
T 细胞谱系之间的共享克隆型
CD8+亚型间存在共享的克隆型，例如CD8+ GZMK和CD8+CTL，治疗前和治疗后（图5D），表明CD8+细胞的不同激活状态之间的转换被PD-1阻断所加强（图5D）。为评估克隆型的稳定性，作者评估了每个T细胞表型在治疗前后的共享克隆型部分，MAIT、CD8+GZMK和CD8+CTL细胞表现出相对的克隆型稳定性，而CD4+细胞在治疗后保留的克隆较少（图5E）。此外，30%的治疗前CD8+ GZMK克隆型与治疗后CD8+ CTL共享。
Chr7/7q缺失与基于ICB的治疗的抗性有关
inferCNV分析AML细胞表明，大部分恶性细胞存在Chr7/7q的丢失（图6A）。10.5%的Chr7/7q缺失患者对治疗有反应，无缺失的患者有36.8%（图6D）。为了使azacitidine与nivolumab效果脱钩，作者对接受了azacitidine的临床试验，无ICB疗法的数据进行分析，表明，35%有chr7/7q缺失的R/R AML患者取得了完全或部分反应，而没有缺失的患者则为17.6%（15/85）（图6E）。这些数据表明，chr7/7q缺失与对nivolumab/azacitidine组合的耐药性有关，但与不含ICB的azacitidine治疗无关。
健康和AML BM的细胞类型差异
作者对8个AML的22个（治疗前8个和治疗后14个）骨髓（bone marrow，BM)抽吸物进行了配对的scRNA和scTCR分析，并在NCT02397720上进行了基于ICB的治疗（图 1A）。AML BM（图 1D）和健康人群的BM（图 1C）相比，AML细胞远离健康细胞，形成了不同的簇。
来自8名患者的22个R/R AML BM 抽吸物中的 60,753个AML和52,641个肿瘤微环境 (TME) 细胞通过了质量评估，被纳入下游分析。使用 scRNAseq 鉴定的 AML 细胞比例与通过临床流式细胞术（r=0.87，p=1.5×10-7）和组织病理学（r=0.73，p=0.0001）测量的原始细胞比例密切相关（图 1F）。治疗前和治疗后的AML细胞按患者聚集（图 1G），而来自不同患者的TME聚集在一起并具有不同的分布（图 1H，I）。AML和TME细胞的聚集模式与其他显示肿瘤间异质性的癌症相似。
图1
治疗后的TCR克隆型展现出可变性
TCR分析可以反映T细胞对检查点阻断疗法的反应。健康BM中只有7.2% (345/4742)的TCR 克隆型在2个或更多T细胞中共享，AML BM中这一值为 51%。克隆型大小（由表达相同TCR序列的细胞数量表示）在健康供体中为1至16个，而在AML中为1至1200个（图 2A），表明AML骨髓中有较高的克隆性。
治疗前，AML患者中贡献最丰富的克隆型的T细胞的频率有明显的变化。治疗后，4名患者（2名反应者和2名SD）扩增了他们最丰富的克隆型（图 2B）。相反，NR (3/3) 患者的最丰富的克隆型收缩（图 2B）。正如预期的那样，健康的 BM T细胞库几乎没有优势克隆（图 2B）。与治疗前（时间点A）相比，3名应答者的克隆性在治疗后（时间点B）有所增加，并持续存在（时间点C），除了PT3（应答者）最初有克隆性增加（时间点B），随后在形态学上AML进展之前，克隆性减少（时间点C）。3 名 NR 和1名SD患者在治疗后其TCR克隆性相对降低，而1名SD患者（PT7）的TCR 克隆性持续增加（图 2C）。
T细胞具有适应性和可变性。为研究处理后克隆型丰度的变化，作者比较了每个克隆型的频率并确定了处理后发生显著变化的频率（图 2D）。新克隆（在预处理时未检测到）占显著扩展克隆型的 43%（图 2D，E）。与临床反应的关联揭示了不同的克隆型变化模式。具体来说，大多数 (77%) 扩增的克隆出现在应答者 (77%) 和 SD 患者 (18%) 中，而在NR和SD患者中发现了大多数（70%）收缩的克隆（图 2F）。这些发现表明，TCR 库对治疗的反应能力是可变的，类似于在实体癌中看到的。
图2
AML患者T细胞群的异质性
作者在22个BM样本中鉴定了25,798 个T细胞中的5种T细胞表型（图 3A）。两种常规CD4+和 CD8+细胞，治疗前分别占53%和35%，治疗后分别占 30.9%和37.4%，治疗前CD4:CD8比为 1.51，低于健康 BMs（1.88），治疗后进一步降至 0.82。3种非常规T细胞γδ 、MAIT和unconv T细胞，治疗前占 2.3%、2.1%和7% ，而治疗后为8.5%、14.4%和8.5%。因此，CD8+、γδ 和MAIT细胞的比例增加，而CD4+ 细胞的比例在所有患者的聚合治疗后减少（图 3A）。此外，5种T细胞表型在8名患者间以及在治疗的不同时间点上有明显的差异（图 3B）。这些发现揭示了患者之间和反应组之间的异质 T 细胞表型，并揭示了治疗后纵向发生的动态变化。
T细胞的亚分类揭示了不同的细胞表型
亚群分析表明，CD4+细胞聚集成CD4+初始和 CD4+效应子亚群，包括 FOXP3+ (Treg)、T 辅助 1 细胞(TH1)、TH17细胞和CD4+细胞毒性 (CTL) 细胞，一个集群无明显表达谱 (CD4NOS)（图 3D）。CD8+簇包括CD8+naïve、CD8+ STAT1、CD8+ GZMK和CD8+ CTL（图 3E）。
通过GSVA测量些细胞的细胞毒性和衰竭程度，CD4+和CD8+的衰竭分随着细胞毒性的增加而增加（图 3D，E）。治疗前，3名响应者的CD4+和CD8+细胞耗竭评分最低（图 3F）。治疗后，CD4+的衰竭评分无变化，而 CD8+ 的衰竭评分在 3 名反应者中显著增加（p < 0.001）（图 3G）。TCGA 队列中具有较高 GZMK表达的 AML 患者总体存活率较高，这表明GZMK升高的固有免疫可以改善 AML 的结果（图 3H）。
图3
伪时间轨迹分析揭示了一个 CD8+连续体
人类有5个颗粒酶基因（GZMA、GZMB、GZMH、GZMM和GZMK），只有GZMA和GZMB的功能得到很好的描述。为了研究颗粒酶的表达是否能反映细胞状态，作者进行了伪时空轨迹分析，发现了一个CD8+连续体，其中CD8+ GZMK细胞是CD8+ naïve细胞和CD8+ CTL细胞的中介（图 4A，B）。GZMA 普遍在非初始 CD8+ 细胞中表达，GZMB 在假时间表达较晚的细胞毒性 T 细胞中表达，GZMK 在较早的假时间中表达显著（图 4C-E）。与 CD8+ CTL细胞相比，CD8+ GZMK细胞中细胞毒性基因GNLY表达水平降低（图 4F）。此外，GZMK与GZMB、GNLY、PRF1、GZMH和PRF1表达及细胞毒性评分负相关（图 4G）。
GZMK表达区分了PT1中的 MAIT亚群
MAIT 细胞的无偏聚类揭示了2种不同的表型（图 4I），且89.9% 的 MAIT 细胞是由具有独特临床过程的 PT1（响应者）贡献的（补充图 6A）。在 PT1 中，经过治疗，MAIT GZMK的比例从 11% 下降到 8.2%，然后是 5.5%；MAIT CTL从 8.2% 增加到22.2%到23.9%（图 4J）。与 CD8+ GZMK细胞相似，MAIT GZMK细胞富含 CD27、LTB、TCF7 和 EOMES（图 4K）。
图4
TCR 克隆型的表型特征
T 细胞中，细胞毒性亚型有更高的克隆型优势（图 5A）。CD8+ GZMK和CD8+ CTL对新克隆的贡献最大，而MAIT CTL的扩增克隆型比例最高，CD8+ CTL具有最高比例的收缩克隆（图 5B）。3 种最丰富的克隆型主要由具有相同或相似表型的细胞类型贡献，例如，CD8+ GZMK和CD8+ CTL为PT2、PT4、PT7和PT8贡献了最丰富的克隆（图5C）。
T 细胞谱系之间的共享克隆型
CD8+亚型间存在共享的克隆型，例如CD8+ GZMK和CD8+CTL，治疗前和治疗后（图5D），表明CD8+细胞的不同激活状态之间的转换被PD-1阻断所加强（图5D）。为评估克隆型的稳定性，作者评估了每个T细胞表型在治疗前后的共享克隆型部分，MAIT、CD8+GZMK和CD8+CTL细胞表现出相对的克隆型稳定性，而CD4+细胞在治疗后保留的克隆较少（图5E）。此外，30%的治疗前CD8+ GZMK克隆型与治疗后CD8+ CTL共享。
图5
Chr7/7q缺失与基于ICB的治疗的抗性有关
inferCNV分析AML细胞表明，大部分恶性细胞存在Chr7/7q的丢失（图6A）。10.5%的Chr7/7q缺失患者对治疗有反应，无缺失的患者有36.8%（图6D）。为了使azacitidine与nivolumab效果脱钩，作者对接受了azacitidine的临床试验，无ICB疗法的数据进行分析，表明，35%有chr7/7q缺失的R/R AML患者取得了完全或部分反应，而没有缺失的患者则为17.6%（15/85）（图6E）。这些数据表明，chr7/7q缺失与对nivolumab/azacitidine组合的耐药性有关，但与不含ICB的azacitidine治疗无关。