上期我们就巨噬细胞的靶向策略进行了实例分析。在免疫细胞中，T细胞充当着不可或缺的角色。它们具有特异性和记忆性，可以被激活并产生针对病原体或肿瘤细胞的免疫反反应。T细胞分为多种类型，包括Th细胞、Tc细胞、Treg细胞等。它们在免疫系统中发挥着不同的作用。探究T细胞在免疫系统中的作用对于理解和治疗与T细胞相关的疾病具有重要意义。针对T细胞的靶向策略的研究也有助于我们开发更有效的免疫治疗方法。这期我们将结合实例分析T细胞在文献中利用AAV的靶向策略。

 

The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adenoassociated virus gene therapy vectors in mice ^[1]

 

主要内容

在这篇研究表明AAV通过TLR9激活小鼠浆细胞DCs，产生Ⅱ型FNs。在体内，TLR9-MyD88途径对于AAV激活CD8 T细胞以及特异性的AAV中和抗体的产生至关重要。研究人员还证明，TLR9依赖性激活针对AAV的适应性免疫是由I型IFNs介导的，人类pDCs可以在体外被激活以诱导I型IFN的产生，这些结果都揭示了TLR9-MyD88Ⅰ型IFN途径的重要作用，干扰这一途径可能会改善AAV介导的人类基因治疗的结果。

如下图，研究人员为了确定TLR9-MyD88途径的生物学意义，建立了一个小鼠骨骼肌介导的基因转移模型。A可以看出AAV2-HA的表达是暂时的，60天完全消失。B图展示了标准的T细胞增殖实验分析了脾细胞的病毒特异性T细胞的激活情况。在WT小鼠中，AAV感染导致强大的T细胞激活，而在Tlr9-/-或Myd88-/-小鼠中，T细胞的激活被明显削弱了。这些结果表明，TLR9-MyD88途径是激活AAV特异性T细胞的关键，导致转基因在体内表达的损失。之后研究人员进一步对细胞毒性的CD8 T细胞对AAV2外壳的反应进行了研究。在Tlr9-/-或Myd88-/-小鼠中，CD8+T细胞对AAV外壳的反应对比WT都有明显减少。这些结果都表明，完整的TLR9-MyD88途径是必需的。

病毒产品	AAV2-CMV
实验动物	C57BL/6& BALB/C
注射方式	腹腔注射
注射量	1×1011 vg

 

An evolved AAV variant enables efficient genetic engineering of murine T cells^[2]

主要内容

 

该研究在AAV6的基础上进化出了一种能够高效转导小鼠T细胞的AAV变体Ark313，并通过CRISPR全基因组筛选确定了QA2是Ark313高效转导的重要因素。Ark313能够实现向小鼠T细胞的高效转基因递送和大片段DNA的有效精确靶向整合，可用于构建更安全更精确的CAR-T和TCR-T细胞。

利用同源定向修复（HDR）将大片段DNA精确靶向并插入到T细胞，已经成为T细胞疗法的变革性手段。使用腺相关病毒（AAV）来递送大片段DNA模板，大大提高了基因插入的效率，但目前仍然缺少一种高效转导T细胞的AAV血清型。为了实现在小鼠T细胞中的靶向基因敲入，研究团队构建了一基于在AAV6型（AAV6）的AAV衣壳库，在此基础上改造进化出了新的AAV血清型——Ark313，其在小鼠T细胞中表现出高转导效率。研究团队还通过基于CRISPR的全基因组敲除筛选，确定小鼠QA淋巴细胞抗原2（QA2）是Ark313能够高效感染的重要因素。接下来，研究团队证明了Ark313可实现对小鼠T细胞高效的不整合的DNA递送、CRISPR-Cas9介导的基因敲除，以及大片段DNA的定向整合。

更重要的是，Ark313能够用于构建TRAC靶向的CAR-T细胞和转基因的TCR-T细胞。这一高效的靶向小鼠T细胞的腺相关病毒血清型为改进T细胞疗法提供了巨大潜力，也为T细胞免疫学研究开辟了新的道路。

 

病毒产品	Ark313-U6
注射方式	直接分离培养原代T细胞
注射量	MOI=1*104

 

Optimizing rAAV6 transduction of primary T cells for the generation of anti-CD19 AAV-CAR-T cells^[3]

 

主要内容

rAAV是目前最广泛使用的基因传递载体，其优点是免疫原性低，几乎没有毒性。然而它对原代细胞的转染效率低，特别是T淋巴细胞。在这项研究中，研究人员优化了rAAV6转导原代T细胞的方案，显著提高了rAAV6传递的CAR基因的表达效率，并成功产生了基于rAAV6的CAR-T细胞（AAV-CAR-T）。此外本研究还表明，rAAV6有效地转导了用OKT3（CD3单克隆抗体）和GENISTEIN（酪氨酸蛋白酶抑制剂）刺激的T细胞。基于上述优化的方法，用rAAV6制备的CAR-T细胞显示出明显的体外和体内的抗肿瘤能力。本研究结果建立了一种高效的AAV转导T细胞的方法，并将为CAR-T细胞的制备提供一种替代方法。

如下图，为了证实优化的方法是否也能提高CAR在T细胞中的表达效率，研究人员使用携带CAR的rAAV6在CMV启动子的控制下转染Jurkat细胞。如A所示，基因改造组的CAR表达量从20%提高到了44%。原代T细胞培养7-10天进行细胞扩增，然后用rAAVCMV-CAR病毒进行转导。在MOI为5 *10⁵时，经过GENISTEIN处理的原代T细胞转导效率增加了23%。此外，在高浓度的OKT3（150纳克/毫升）条件下，CAR的表达效率在5*10⁵的MOI下增加了40%。

 

病毒产品	AAV6-CMV
实验动物	C57BL/6& BALB/C
注射方式	腹腔注射
注射量	1×1011 vg

 

 

参考文献…

1. Zhu, J., X. Huang, and Y. Yang, The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. J Clin Invest, 2009. 119(8): p. 2388-98.

2. Nyberg, W.A., et al., An evolved AAV variant enables efficient genetic engineering of murine T cells. Cell, 2023. 186(2): p. 446-460 e19.

3. Wang, D., et al., Optimizing rAAV6 transduction of primary T cells for the generation of anti-CD19 AAV-CAR-T cells. Biomed Pharmacother, 2022. 150: p. 113027.