Prime Editor——v3em PE-AAV双载体系统，实现体内多器官编辑

多数致病遗传变异是碱基点突变、插入或缺失突变引起的，因此探索如何在活细胞内修复这些突变，使细胞恢复正常，一直是生命科学的一个长期目标。在过去的几年里兴起了一种无需双链断裂、无需供体模板的新型基因编辑工具——引导编辑(Prime Editing, PE)，PE已展现出纠正致病突变、插入保护性等位基因的巨大潜力。

初代的引导编辑效率偏低，David Liu团队对pegRNAs进行了系统性改造并取得良好效果。David Liu团队的新研究中，通过优化双AAV载体系统，成功实现了小鼠脑、肝、心等多器官的高效Prime编辑，为基因治疗提供了新的技术手段。接下来让我们一起看看v3em PE如何发挥功能吧！

v3em PE引导编辑系统由向导RNA（epegRNAs）引导，逆转录酶MMLV与nCas9组成的融合蛋白辅助，可实现目标位点碱基的精准编辑（替换、插入、删除）。

v3em PE-AAV系统主要包含三个组分：epegRNAs，逆转录酶MMLV与nCas9；其中MMLV与nCas9的编码蛋白序列长度（约6.3 kb），远超AAV载体的包装极限（4.7 kb）。为突破这一限制，将v3em PE与分裂型内含肽（intein）结合，设计为双AAV载体系统：

将PE编码序列在nCas9的第1024位氨基酸处拆分，分别与来源于念珠藻的Npu DnaB快速剪接内含肽的N端和C端融合，构建在两个AAV载体上。共转染两个AAV后，内含肽通过自剪切作用重新组成装完整的PE蛋白，恢复编辑功能。

启动子升级：采用强启动子Cbh替代传统的EFS启动子，显著提升PE蛋白表达水平。

epegRNA稳定化：通过在传统的pegRNA的3'端添加tevopreQ1修饰及8 nt linker，显著优化了pegRNA的稳定性、编辑效率和特异性; 与传统pegRNA相比，这些优化的epegRNA将编辑效率提高了1.5- 4倍。

编辑策略: 使用高保真度的引导RNA（epegRNA）和单导向nicking sgRNA（sgRNA）来指导PE到目标DNA位点(nicking sgRNA设计距离编辑位点40-90 nt)。

PCSK9 Q152H是“天然保护突变”，通过降低LDL-C水平显著减少冠状动脉疾病风险，同时无明显不良反应，可视为一种“有益突变”。文献利用v3em PE-AAV双载体系统，成功在成年小鼠的肝脏中实现31%和38%的精准编辑；编辑小鼠与未处理的小鼠相比，总血浆胆固醇比同龄未处理小鼠降低了20%，血浆低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平降低27%。

验证了优化的v3em PE3-AAV系统可以在体内实现强大且治疗相关的原位编辑，实现在相关组织中安装基因组突变。

v3em PE3-AAV系统展现出良好的生物安全性：

- 脱靶效应：通过CIRCLE-seq技术评估10个潜在脱靶位点，未检测到显著脱靶编辑，验证了Prime编辑的高特异性。

- 毒性评估：血清转氨酶（ALT、AST）水平与肝组织病理切片均未见显著异常，表明v3em PE-AAV系统无明显肝毒性。

作为新一代精确基因编辑方法，Prime Editor具有其新颖性。吉凯可以根据客户的需求，通过设计个性化的epegRNA和nicking sgRNA，实现目标基因的编辑。

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【参考文献】

1.Davis, J.R. et al. Efficient prime editing in mouse brain, liver and heart with dual AAVs. Nat Biotechnol (2023).

2. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. *Nature* 576, 149-157 (2019).

3. Davis, J. R., et al. Efficient in vivo prime editing in mouse brain, liver and heart with dual AAVs. *Nature Biotechnology* 42, 253-264 (2024).

4. Chen, P. J., et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. *Cell* 184, 5635-5652 (2021).

5. Nelson, J. W., et al. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. *Nature Biotechnology* 40, 402-410 (2022).

6. Arboleda-Velasquez, J. F., et al. Resistance to autosomal dominant Alzheimer’s disease in an APOE3 Christchurch homozygote: a case report. *Nature Medicine* 25, 1680-1683 (2019).