Adv Sci：转录组+蛋白质组揭示间充质干细胞来源的凋亡小泡靶向调控CD8+ T细胞稳态缓解超敏反应的作用机制

凋亡是维持多细胞生物稳态的重要过程。间充质干细胞（mesenchymal stem/ strom cells, MSCs）来源的凋亡囊泡Apoptotic vesicles（MSCs-ApoVs）作为天然脂质纳米颗粒，继承了亲本细胞的特性，在免疫治疗中具有潜力，但在CD8⁺T 细胞介导的超敏反应中的治疗作用尚不明确。IV 型超敏反应（如接触性超敏反应、口腔苔藓样反应）由 CD8⁺T 细胞介导，现有治疗多以对症处理为主，缺乏靶向性。人脱落乳牙干细胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED）作为 MSCs 亚型，具有优异的免疫调节能力，但其来源的凋亡囊泡（SHED-ApoVs）对免疫微环境及CD8⁺T 细胞的影响尚不明确。

近日，来自空军军医大学的研究团队通过构建小鼠接触性超敏反应(contact hypersensitivity, CHS)和口腔苔藓样反应(oral lichenoid reactions, OLR）两种模型，探究 SHED-ApoVs 对 CD8⁺T 细胞介导的 IV 型超敏反应的治疗作用及机制，并通过临床样本验证，为纳米囊泡基无细胞疗法提供理论依据。

研究使用的人脱落乳牙干细胞SHED具有MSCs的一般特性，表达 MSCs 表面分子 CD90、CD105、CD73 和 CD29。采用星形孢菌素诱导凋亡，显微镜下可观察到 SHED 凋亡过程中的肿胀和球形化。透射电镜显示 ApoVs 呈典型的双膜球形结构。与未诱导的 SHED 相比，ApoVs 表达特异性凋亡相关标志物 cleaved-caspase3，表明从 SHED 分离的 ApoVs 具有高纯度的 MSCs 来源凋亡囊泡的特异性特征。

采用恶唑酮（OXA）作为半抗原构建小鼠接触性超敏反应模型，并注射 ApoVs。与正常组相比，对照组出现局部皮肤轻度充血和发红等激发反应，而 ApoVs 注射组反应减轻。对对照组和 ApoVs 注射组的耳样本进行 RNAseq，发现222 个上调和 198 个下调的差异表达基因。上调基因主要与代谢和凋亡过程相关，提示 ApoVs 处理可促进局部组织的代谢和凋亡过程，下调基因与炎症和免疫反应显著相关，提示耳部超敏反应导致组织炎症和免疫反应。ApoVs 处理后，免疫染色显示病变部位促炎 TNF-α⁺细胞表达减少，抗炎 TGF-β⁺细胞表达增加。ApoVs 注射 24 小时后，病变部位 CD8⁺T 细胞的比例降低。这些均表明SHED-ApoVs 处理可通过降低病变部位 CD8⁺T 细胞的比例，有效改善超敏反应诱导的炎症和免疫反应。

通过过继转移实验验证 ApoVs 是否在激发阶段通过特异性靶向 CD8⁺T 细胞减轻超敏反应。 ELISA 分析显示，ApoVs 处理后 CD8⁺T 细胞效应细胞因子（包括IFN-γ、TNF-α、穿孔素-1 和颗粒酶B）的表达降低。注射 ApoVs 处理的 CD8⁺T 细胞的受体小鼠耳部发红和肿胀显著低于注射PBS处理的 CD8⁺T 细胞的小鼠。研究观察到受体小鼠的耳部超敏反应依赖于注射的致敏CD8⁺T 细胞。这些发现表明，ApoVs 在超敏反应的激发阶段对 CD8⁺T 细胞具有直接抑制作用。以 PBS 处理的 CD8⁺T 细胞为对照，对 ApoVs 处理的 CD8⁺T 细胞进行 RNA seq，发现ApoVs 处理组的上调基因显著富集于凋亡相关信号通路。流式分析及细胞共定位发现ApoVs 处理显著诱导 CD8⁺T 细胞凋亡，表明 ApoVs 处理通过抑制 CD8⁺T 细胞功能并诱导其凋亡，显著改善超敏反应。

对ApoVs 进行蛋白质组学分析，发现上调蛋白质的前 10 个富集通路显著富集于线粒体功能相关，如 ATP 水解活性和电子传递活性，提示 ApoVs 通过影响线粒体通路诱导 CD8⁺T 细胞凋亡。追踪线粒体形态并进行线粒体膜电位检测后，发现ApoVs 处理导致 CD8⁺T 细胞的线粒体结构发生明显改变，表现为点状和碎片化形态，线粒体膜电位显著下降，表明ApoVs 处理通过影响线粒体的形态和功能诱导 CD8⁺T 细胞凋亡。

通过SIM² 荧光成像及扫描电镜观察到CD8⁺T 细胞膜上 ApoVs 的存在呈时间依赖性增加，ApoVs 处理 4 小时后观察到明显的膜融合，表明 SHED-ApoVs 主要通过膜融合诱导 CD8⁺T 细胞凋亡，导致线粒体功能障碍。Fluo-8AM 钙内流检测显示，ApoVs 处理可瞬时增加 CD8⁺T 细胞内钙离子水平，WB实验也发现ApoVs 处理可增强L 型钙通道蛋白 Cav1.2 和 Cavβ1 的膜表达，免疫荧光染色显示，ApoVs 处理后 CD8⁺T 细胞中 Cav1.2 和 Cavβ1 的表达水平随钙内流增加，表明ApoVs 通过与 CD8⁺T 细胞融合引发钙内流，导致L 型电压门控钙通道上调及随后的钙超载。

进一步用L 型钙通道抑制剂verapamil处理发现，抑制剂处理可减少 ApoVs 介导的细胞内钙内流，并减轻线粒体膜通透性，导致线粒体膜电位升高，线粒体 ROS 水平降低，表明抑制钙内流可改善线粒体功能。组织形态学观察和相对耳厚度测量进一步证实，阻断钙内流可降低 ApoVs 对接触性超敏反应小鼠的治疗效果。

共定位染色和线粒体分离显示，ApoVs 处理后 CD8⁺T 细胞中 BAX（一种关键促凋亡蛋白） 与线粒体（Mitotracker）的共定位显著增加；使用verapamil抑制 L 型钙通道后，BAX 与 Mitotracker 的共定位显著减少。这些发现表明ApoVs 通过 L 型钙通道促进钙超载，诱导线粒体功能障碍，启动 CD8⁺T 细胞凋亡，从而改善 CHS 反应。

为进一步验证 ApoVs 在 IV 型超敏反应中的治疗效果，构建了另一种口腔苔藓样 OLR 小鼠模型（病理上属于 IV 型超敏反应）。激发阶段，在小鼠颊黏膜涂抹 OXA 后可观察到网状条纹，H&E染色可见黏膜下层带状淋巴细胞浸润，与口腔扁平苔藓（OLP）特征高度相似ApoVs 注射处理组中，这些炎症表现显著减轻。免疫染色显示，与 PBS 注射相比，ApoVs 注射可减轻血管重塑，降低 TNF-α 表达。且注射后 CD8⁺T 细胞的比例也降低。收集 3 名健康志愿者和 3 名 OLR 患者的外周血样本，富集并激活 CD8⁺T 细胞，用 ApoVs 或 PBS 处理 OLR 患者的 CD8⁺T 细胞，发现体外 ApoVs 处理可显著降低患者 CD8⁺T 细胞分泌的穿孔素-1、颗粒酶B、TNF-α 和IL-1β水平。此外，ApoVs 处理后，患者 CD8⁺T 细胞线粒体通透性增加，与 CHS 模型结果一致。文章数据表明，MSCs来源的 ApoVs 可诱导 CD8⁺T 细胞凋亡，改善 CD8⁺T 细胞介导的 IV 型超敏反应，为 MSCs 来源 ApoVs 的临床前和临床研究提供了新见解。

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