技术指南！AAV感染免疫细胞（单核细胞和巨噬细胞）的方法

目前，AAV在体内由于特异性启动子和血清型的存在，可以靶向多种组织的细胞，在肝脏、肾脏、心脏等多种器官里靶向性较好，但是目前在免疫细胞当中的靶向性一直是一个难题。在AAV感染免疫细胞的类型中，目前老师们经常问到单核细胞和巨噬细胞的感染方法，今天我们就这两类细胞来做一个详细介绍。

单核细胞和巨噬细胞都是白细胞的类型，它们作为先天免疫系统的一部分，提供了抵御入侵微生物和外来颗粒的第一道防线。大多数单核细胞和巨噬细胞来源于位于骨髓的造血干细胞，它们首先必须分化成常见的髓系前体细胞[1,2]，随后成为粒细胞-巨噬细胞前体。这种细胞类型可以成为粒细胞前体（最终成为嗜碱细胞、中性粒细胞或嗜酸细胞），或者通过单核母细胞然后是前单核细胞，成为单核细胞[3]，随后成为巨噬细胞。

目前，AAV感染中性粒细胞，体内实验可以选择用cd11b启动子，具体验证可以看一下这篇文献，该研究[5]急性和慢性中耳炎（AOM 和 COM）是常见的中耳感染，可导致听力损失和其他并发症。最近的研究表明，巨噬细胞和核因子红细胞 2 相关因子 2 （Nrf2） 信号通路都参与了中耳炎的免疫反应和消退。

在通过注射高剂量LPS确认AOM的诱导后，作者用LPS治疗30只小鼠，并在第7天通过鼓膜切开术提取OME。然后通过流式细胞术从 OME 中分选巨噬细胞。使用ELISA 检查 OME 巨噬细胞中Nrf2的水平.小鼠再留3周（LPS后4周），检测OME中炎症细胞募集和巨噬细胞极化，小鼠OME中主要促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNFα和IFNɣ水平，以及中耳黏膜组织中ROS、MDA、GSH和SOD水平。检查了第7天 OME巨噬细胞中 Nrf2 水平与这些与 AOM 分辨率相关的参数之间的相关性。作者的数据表明，第7天OME 巨噬细胞中较低的 Nrf2 水平与OME 中中性粒细胞的增加显着相关（p<0.0001）、OME 中更多的巨噬细胞 （p<0.0001），巨噬细胞的M2 极化百分比较小（p=0.0002）、更高水平的IL-1β （p=0.009）、IL-6 （p=0.001）、TNFα（p=0.004）和IFNɣ（p=0.003）中，ROS 水平更高（p=0.004）和MDA（p=0.007）和低水平的SOD（p=0.003）和 GSH（p<0.0001）在LPS后4周在中耳粘膜组织中，表明OME巨噬细胞中Nrf2的减少可能导致未治愈的AOM或COM的发展。

（A）在巨噬细胞特异性CD11b启动子（AAV-pCD11b-Nrf2）下含有Nrf2的AAV（血清型6）和在CD11b启动子（AAV-pCD11b-Scr）下含有扰乱序列（Scr）的对照AAV的示意图。两种病毒还携带绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，通过 p2A 构建体与转基因连接，从而允许表达由 CD11b 启动子控制的两种转基因。（B）通过荧光和明场通道在体外转导的BMDM和3T3细胞。BMDM，但不是 3T3 成纤维细胞系，在用两种病毒转导时显示出绿色荧光，从而证实了 CD11b 启动子的特异性。（C、D）通过RT-qPCR（C）和ELISA（D）定量转导的BMDM中Nrf2水平。

作者研究了BMDMs中Nrf2表达对巨噬细胞极化的影响。将AAV-pCD11b-Nrf2转导到BMDM中，导致CD163+ BMDM显着增加，如代表性流程图所示和定量。在AAV-pCD11b-Nrf2转导的BMDM中，iNOS、IL-1β、IL-6、TNFα和IFNɣ的表达显著降低，而精氨酸酶1和CD163的表达显著升高。此外，用AAV-pCD11b-Nrf2 转导导致精氨酸酶活性显着增加和ROS产量显著减少在BMDM中。总之，这些数据表明Nrf2诱导巨噬细胞的M2样极化。

（A）和定量（B）显示。（C）转导的 BMDM 中 iNOS、IL-1β、IL-6、TNFα、IFNɣ、精氨酸酶 1 和 CD163的ELISA。（D）精氨酸酶活性。（E）ROS生产。

由此，目前体内感染单核巨噬细胞，目前可以选择CD11b启动子，目前吉凯也可以提供CD11启动子的现成载体，供老师们选择。

【参考文献】

[1] Human monocyte subsets and phenotypes in major chronic inflammatory diseases. doi: 10.3389/fimmu.2019.02035

[2] Macrophage cytokines: Involvement in immunity and infectious diseases. doi: 10.3389/fimmu.2014.00491

[3] Nuclear morphologies: Their diversity and functional relevance. doi: 10.1007/s00412-016-0614-5

[4] Increased monocyte abundance as a marker for relapse after discontinuation of biologics in inflammatory bowel disease with deep remission. doi: 10.3389/fimmu.2022.996875

[5] Nrf2 orchestrates transition from acute to chronic otitis media through inflammatory macrophages. Doi：10.3389/fimmu.2023.1170388