抗体制备系列（三）——噬菌体展示技术

1985年，科学家George Smith进行了一项看似不可能的实验：他将一种核酸内切酶基因插入丝状噬菌体的外壳蛋白基因中，结果发现噬菌体表面竟成功展示了功能完整的酶分子——这些酶能被特异性抗体识别中和，如同天然酶一样工作。这个颠覆性创意不仅催生了噬菌体展示技术，更为他赢得了2018年诺贝尔化学奖的桂冠。

如今，噬菌体展示技术作为一种强大的生物技术手段，犹如一把神奇的钥匙，为抗体筛选领域打开了全新的大门，在生物医学研究和药物开发等领域发挥着至关重要的作用。

噬菌体展示技术，顾名思义，其核心角色就是噬菌体（一种专门侵染细菌的病毒）。这项技术的基本原理，是将外源蛋白或多肽的 DNA 序列精准地插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的恰当位置。随后，当这段融合基因表达时，目标蛋白就会像旗帜一样“展示”在病毒颗粒表面，而它的基因则安全地包裹在噬菌体内部。这一设计实现了表型（展示的蛋白或抗体）与基因型（内部DNA）的完美统一。此外，被展示的蛋白不仅保持天然结构和活性，还能直接结合特定靶分子。更巧妙的是，结合靶抗原的噬菌体被回收后，可通过感染大肠杆菌进行扩增，使目标基因获得指数级富集。

基于以上的原理，噬菌体展示技术应用于抗体筛选的过程中，将抗体的基因型（携带抗体基因的噬菌体 DNA）与表型（展示在噬菌体表面的抗体蛋白）紧密联系在一起，为后续的筛选工作奠定基础。抗体筛选领域中，以M13为代表的丝状噬菌体最常用。它们通过次要衣壳蛋白PⅢ（展示大分子如抗体片段）或主要衣壳蛋白PⅧ（展示小肽）呈现外源蛋白。其温和特性（不裂解宿主）使其成为抗体药物开发的黄金平台。

噬菌体展示如同分子世界的“淘金”过程，核心步骤环环相扣：

将抗体基因插入噬菌粒载体（如PIII或PVIII外壳蛋白基因），转化大肠杆菌，收集噬菌粒，构建得到容量达10⁹-10¹¹的多样性抗体文库。这个库就像是一个巨大的 “抗体宝藏库”，理论上包含了针对各种抗原的抗体基因，其多样性越高，后续筛选出理想抗体的可能性就越大。抗体基因的来源有天然库（如健康人B细胞），免疫库（如免疫动物：小鼠、羊驼等），合成库（结合天然框架区和合成CDR区）。

让文库与固定靶标（如抗原）结合，洗去未结合的游离噬菌体。现代技术已开发出双层膜筛选系统，可避免细胞碎片干扰；还有选择性感染技术，只有结合靶标的噬菌体才能感染宿主，一步完成筛选扩增。

将洗脱回收的噬菌体感染大肠杆菌扩增，获得富集后的子代文库，其目标噬菌体富集度可提高100-1000倍。通常经过4-5轮的“结合—洗脱—扩增”的循环筛选，能够将与靶抗原特异性结合且亲和力高的噬菌体逐步富集出来。

将最终轮噬菌体感染细菌，挑取单菌落培养，获得单克隆噬菌体抗体，用ELISA或SPR检测抗体亲和力。

噬菌体展示技术在抗体发现中具有显著优势，已成为现代抗体药物开发的核心工具之一。以下是该技术的主要优势：

针对免疫耐受程度高的靶抗原，噬菌体展示技术可以绕过动物免疫系统限制，直接从人工合成的抗体库或天然抗体库中筛选目标抗体。其靶抗原可以是毒性抗原、高度保守抗原（传统动物免疫难以产生抗体）或非免疫原性小分子等。

全人源抗体库的使用，可避免抗体开发后期复杂的人源化改造和筛选过程。

在传统的杂交瘤抗体筛选方法中，筛选过程往往耗时费力。噬菌体抗体文库的库容可达10⁹-10¹¹，多样性丰富，极大地提高了筛选效率。此外得益于噬菌体的扩增效率，噬菌体展示技术可以在短时间内从庞大的抗体库中快速筛选出目标抗体，其周期最短可控制在4-6周，大大加速了抗体研发的进程。

噬菌体展示技术可展示多种抗体片段，如scFv（单链抗体），Fab（抗原结合片段），VHH（纳米抗体）和双特异性抗体等，以满足多样化的抗体开发需求。

噬菌体展示技术在抗体发现中虽具显著优势，但其应用仍存在多方面的技术缺陷和局限性。

1. 非特异性干扰：在生物淘选（Biopanning）过程中，由于噬菌体与靶分子之间可能存在非特异性结合，或者在筛选过程中受到实验条件、杂质等因素的干扰，导致一些并非真正特异性结合靶分子的噬菌体也被富集出来，产生假阳性，导致目标抗体被"淹没"。即使经多轮富集，目标抗体可能因扩增偏差而丢失。

2. 扩增偏差影响富集效率：文库中高复制能力的噬菌体可能掩盖低丰度高亲和力克隆。深度测序显示，某些靶点的目标抗体在四轮淘选中未被有效富集，反而出现非功能性变异体主导的现象。

1. 缺乏天然免疫成熟过程：使用天然库或合成库进行噬菌体展示筛选时，抗体未经体内亲和力成熟，初始亲和力常低于动物免疫来源抗体。对于一些需要高亲和力抗体的应用场景（如治疗性抗体开发），往往需要对筛选出的抗体进行亲和力成熟。然而，亲和力成熟的过程较为复杂，需要通过多轮的基因突变和筛选来逐步提高抗体的亲和力，这对实验技术和时间成本都提出了较高的要求。

2. 翻译后修饰缺失：在大肠杆菌中表达的抗体片段（如scFv、Fab）缺乏糖基化等真核修饰，可能影响抗体稳定性与功能。需后续转哺乳细胞表达验证，增加开发周期和风险。

3. 构象表位识别受限：部分构象表位复杂的抗原（如多次跨膜蛋白GPCR）在噬菌体展示筛选中难以保持天然结构，导致漏筛。

2002年，阿达木单抗成为第一个通过噬菌体展示获得上市批准的全人重组抗体，此后噬菌体展示方面相继有多个抗体药物上市。噬菌体展示技术作为一种强大的抗体筛选工具，已在抗体开发领域被广泛应用。目前，吉凯基因抗体团队亦通过噬菌体展示技术，于个性化免疫库（小鼠、羊驼等）中成功进行多个靶点的治疗性抗体开发。

尽管目前还面临着一些挑战，但随着技术的不断发展和完善，相信它将在抗体药物研发领域发挥更为重要的作用。