分裂内含肽火了！突破 AAV 容量，助力大蛋白体内递送与基因编辑！

在基因治疗和生命科学研究中，大型功能蛋白的应用越来越广泛，但其编码基因长度常常超出AAV载体约4.7 kb的包装极限，严重制约了发展。分裂内含肽技术的出现，成功打破这一壁垒，为实现大蛋白的高效递送提供了全新路径。

分裂内含肽（Split intein）是一种能够高效连接蛋白片段且连接后无痕的天然蛋白质序列，在基因编辑和合成生物学中展现出巨大潜力。通过将一个大蛋白拆分为两个部分，并在细胞内重新组装为完整功能蛋白，分裂内含肽系统成功解决了腺相关病毒载体容量有限的问题，为体内递送大基因及大型基因编辑工具如 Prime Editor 提供了可行方法。

分裂内含肽可以自我切除并连接两侧外显肽（extein），它能够通过自催化机制实现蛋白质片段的精准拼接，这一过程不需要额外的辅因子或酶参与，具有高度特异性。

在Npu DnaE分裂内含肽系统中，NpuC和NpuN来自Nostoc punctiforme的DnaE：

NpuN：包含内含肽的N端部分，具有自剪接活性

NpuC：包含内含肽的C端部分，与NpuN协同完成剪接反应

设计时将目标蛋白在柔性区域切割为两段，分别与 NpuN 和 NpuC 融合表达。当这两个部分在细胞内共表达时，内含肽介导的剪接反应，将两侧的“外显肽”无缝连接成一个完整的功能蛋白。

腺相关病毒（AAV）包装容量限制在~4.7kb以内，而引导编辑工具 Prime Editor蛋白长度超过 6 kb，单个AAV无法包装下；分裂内含肽系统通过合理设计，很好的突破AAV载体的容量限制问题：

• 构建双 AAV 系统：将编辑蛋白分为 N 端和 C 端两部分，包装成两个 AAV 病毒；

• 内含肽介导的细胞内重组：两个 AAV 病毒共感染细胞，NpuN 与 NpuC 触发剪接，形成具有完整编辑活性的蛋白；

• 编辑效率验证：结合分裂内含肽的引导编辑系统v3em PE-AAV系统实现了高达 42%~46% 的编辑效率，是目前较高效的 AAV 介导体内编辑系统之一。

此外，该系统也适用于其它大蛋白，如杜氏肌营养不良症（DMD基因）、Cas9 核酸酶等。

嘌呤霉素蛋白不同分裂位点效率验证

1：分裂位点选择：应优先选择柔性区域或非保守区，避免破坏蛋白整体折叠与功能(侧翼残基和局部蛋白质折叠会影响内含肽介导的反式剪接的效率)。

2： C 端外显肽起始氨基酸：C端外显肽的前几位氨基酸是维持剪接反应的关键活性位点，会显著影响剪接效率；设计时需根据不同内含肽的特点选择适合的目的蛋白分裂位点。

3 ：分裂位点评估：选多个候选位点，验证不同位点的分裂蛋白在细胞内的重组效率，选择效率高的位点继续下一步实验。

声明：吉凯基因团队专注介绍生命科学领域前沿研究方法。本文仅作为信息交流的目的，文中观点不代表吉凯基因支持文中观点或者方案推荐。如需获得实验方案指导，请自行查阅文献。

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