生命起源密码被破译！多层蛋白质组学首次全景揭示哺乳动物胚胎发育黑箱~

在生命起点，受精卵如何一步步分化出构成生物体的万千细胞，最终形成复杂组织与器官？早期胚胎发育，特别是原肠胚形成阶段，一直是生物学研究的核心难题。这一时期，胚胎确立内、中、外三个胚层，为所有组织器官发育奠定基础。

尽管研究人员已通过成像、转录组测序等技术对类原肠胚细胞特化进行表征，但基因转录与蛋白质表达之间存在显著不一致，翻译后修饰对蛋白质功能的影响更是难以通过核酸研究完全揭示。这使得我们对胚胎发育的理解始终存在关键的"知识盲区"。

多层蛋白质组学系统描绘发育动态

2024年7月，国际顶刊《Cell Stem Cell》发表荷兰拉德堡德大学团队的突破性研究。该研究利用小鼠原肠胚样体模型，通过多层蛋白质组学技术（蛋白质组、磷酸化蛋白质组、单细胞蛋白质组等）首次系统描绘了早期胚胎发育过程中的蛋白质表达动态，实现了对发育分子机制的全方位捕捉。

为解析原肠胚样体形成过程中蛋白质表达的动态变化，研究团队对未分化 mESCs（0h）至 120h 原肠胚样体的 5 个时间点进行了两次生物学重复实验，采用无标记定量（LFQ）质谱技术开展分析，共鉴定到 5079 种蛋白质，其中 87%-95% 的蛋白质在重复间重叠。

PCA分析显示，样本按发育时间点清晰分离，反映出分化过程中蛋白质组的显著动态变化，层次聚类将差异表达蛋白质分为 4 个簇，分别对应胚层形成与细胞谱系特化、胚层分化启动、多能性维持、晚期组织分化等过程。

GO富集分析显示，120h 原肠胚样体中 “白血病抑制因子（LIF）响应” 通路受抑制（与多能性退出一致），而 “动物器官形态发生”“Wnt 信号通路”“神经发育” 等与胚胎分化相关的通路显著富集。通过同步生成各时间点 RNA-seq 数据，发现部分差异表达蛋白质与 mRNA 动态一致。

鉴于原肠胚样体可模拟胚胎着床后发育特征，而此前蛋白质组研究仅覆盖着床前胚胎，研究团队对胚胎日E7.5 至 E9.5 的小鼠胚胎进行了蛋白质组分析，并与原肠胚样体对比，天然胚胎共鉴定到 5998 种蛋白质，E9.5 胚胎中胚胎珠蛋白和肌球蛋白重链蛋白高表达，分别对应红细胞生成和心肌发育过程；E8.5 和 E9.5 胚胎被分为前体（头部区域）和后体（躯干区域），后体高表达 CDX4、HOXB9 等躯干发育相关蛋白，前体高表达 DDX10 及 RPL38（通过调控 Hox mRNA 翻译参与轴骨骼模式形成）。

肠胚样体与胚胎的蛋白质组共检测到 4736 种重叠蛋白质，胚胎特有的蛋白质富集于 “模式形成”“免疫反应”“心脏发育” 等通路（原肠胚样体缺乏这些复杂结构）。E9.5 胚胎与 96-120h 原肠胚样体高度匹配；且多能性（如 POU5F1）、神经发育（如 NES）、体节分化（如 MEST）相关蛋白的表达趋势在两者中一致，证实原肠胚样体可模拟天然胚胎的蛋白质组特征。

为解析信号通路在原肠胚样体形成中的动态调控，研究团队对 0h、72h、120h 样本进行磷酸蛋白质组分析，聚焦磷酸化修饰（翻译后修饰的关键形式）的变化，共鉴定到 20380 个磷酸化位点。在重叠蛋白质中，1151 种蛋白质同时存在表达量和磷酸化水平变化，412 种蛋白质仅磷酸化水平变化（与蛋白质表达无关），提示磷酸化修饰的独立调控作用。

信号通路与激酶活性动态：通路富集分析显示，120h 原肠胚样体中 “剪切应力信号” 受抑制，“RNA 剪接”“胚胎发育” 相关信号通路激活（与分化需求一致）；激酶富集分析（KEA2）发现，未分化 mESCs 中 CDK2、CDK1、GSK3B、P38-MAPK14、DYRK2 等激酶活性更高，而 GSK3B 活性降低与原肠胚样体培养中使用 CHIR99021（GSK3B 抑制剂）处理一致。

转录因子的磷酸化特征：120h 原肠胚样体中磷酸化转录因子占比（9.2%）显著高于 72h（4.1%）和 0h（3.0%），且以 C2H2 型锌指家族为主（小鼠基因组中最大的转录因子家族），未分化 mESCs 中检测到多能性调控因子 KLF 家族的磷酸化；120h 原肠胚样体中鉴定到 SALL1 的多个磷酸化位点（抑制其与 NuRD 复合物结合并影响转录功能）、CTCF（S402 磷酸化降低 DNA 结合亲和力）；同源域转录因子（如 HOXC9、IRX3）在 120h 原肠胚样体中特异性磷酸化，与早期胚胎细胞命运决定的已知功能一致。

为解析内、中、外三个胚层的蛋白质表达特征及细胞异质性，研究团队构建了三重荧光报告基因 mESC 系（外胚层 MT1-BFP、中胚层 BRA-GFP、内胚层 SOX17-RFP），结合流式分选（FACS）、蛋白质组和单细胞蛋白质组（SCP）技术开展分析。

1、胚层特异性蛋白质组：

胚层细胞分选与验证：120h 原肠胚样体中，RFP+（内胚层）、BFP+（外胚层）、GFP+（中胚层）细胞占比分别约为 4%、6%、>20%，FACS 分选后 RNA 检测证实各群体高表达对应胚层标志物（如内胚层 FOXA2、外胚层 POU5F1、中胚层 MEST）。

胚层差异蛋白质表达：共鉴定到 4795 种蛋白质，其中 2708 种在 4 个细胞群体（3 个胚层 + 三阴性细胞）中差异表达，各胚层有不同特异性标志物。外胚层细胞中 PRC2 复合物、微小染色体维持复合物（MCM）、前折叠素复合物等表达上调，内胚层细胞中线粒体膜 ATP 合酶复合物、液泡 ATP 酶复合物、肌动蛋白相关蛋白 2/3 复合物富集；中胚层细胞中视黄酸信号通路相关蛋白高表达，三阴性细胞（以神经外胚层为主）富集神经发育相关通路。

2、单细胞蛋白质组（SCP）解析细胞异质性

SCP 检测深度与群体分离：对分选的 3 个胚层细胞和未分化 mESCs 进行 SCP 分析，560 个单细胞通过质控，共鉴定 2259 种蛋白质（单细均 1541 种）；PCA 显示 675 个差异蛋白质（ANOVA q<0.01）可清晰区分不同细胞群体，且分离不受 TMT 标记影响；ANXA5（内胚层）、ESRRB（mESCs）、TGM1（中胚层）等蛋白质的表达与细胞类型高度匹配。

未分选原肠胚样体的细胞聚类：对未分选原肠胚样体单细胞分析（2088 种蛋白质 / 单细均 1424 种），UMAP 投影显示 mESCs 与胚层细胞形成独立簇，且多数原肠胚样体细胞与 BRA-GFP + 细胞（中胚层）聚类，符合原肠胚样体中胚层占比高的特征；随机打乱数据后聚类消失，证实聚类的生物学意义。

中胚层细胞的亚型细分：对 BRA-GFP + 细胞单独开展 SCP 分析（363 个单细胞，1822 种蛋白质 / 单细均 1605 种），通过 K-means 聚类识别出 3 个亚群，结合 scRNA-seq 标志物验证，分别对应体节前中胚层（PAFAH1B3、ALDH1A2）、神经中胚层祖细胞（NMP，TRHAP3、SUMO1）和体节（YBX3、RFC5），并发现角蛋白在特定中胚层亚群中富集（排除污染后提示其可能参与形态发生适应）。

为解析胚胎分化中的转录调控机制，研究团队通过 P300 邻近标记鉴定增强子结合蛋白，并对关键转录因子进行功能验证。

1、  P300 邻近标记解析增强子蛋白质组

利用 CRISPR-Cas9 技术构建 P300-V5-miniTurboID 敲入细胞系，ChIP-seq 显示 mESCs 和 120h 原肠胚样体中分别检测到 31100 和 53474 个 P300 结合位点，且主要位于内含子和远端基因间区（增强子典型区域）；P300 结合位点分为 mESC 富集（17437 个）、共享（13663 个）、原肠胚样体富集（39811 个）三类，共享位点的 ChIP-seq 信号最强。

motif 分析显示，mESC 富集的 P300 位点含 NANOG、SOX2、POU5F1 等多能性转录因子 motif，原肠胚样体富集位点含同源域 motif（如 HOX 家族）及 ZIC1/3/4、TCF7L2 等胚胎分化相关 motif；ANANSE 算法预测 HOX 转录因子、心房标志物（HEY1、NR2F2）及 RFX4 等为原肠胚样体分化关键调控因子。

对P300 邻近蛋白质鉴定，mESCs 中鉴定 250 种 P300 邻近蛋白，包括 Mediator 复合物、SWI/SNF 复合物及 SALL4、NANOG 等转录因子；原肠胚样体中鉴定 161 种 P300 邻近蛋白，含 64 种原肠胚样体特异性蛋白（39 种仅在原肠胚样体中检测），包括 SWI/SNF 复合物亚基 SMARCD3（神经祖细胞特异性）、GLTSCR1（GBAF 复合物成员，推测从启动子向增强子重定位），以及 PRTH/PHF14 复合物（与神经发育疾病相关）；原肠胚样体中 ZEB2、NANOG 等转录因子的 P300 邻近富集显著（log2 FC>2，p<0.05），HOXB9、CDX2 等 log2 FC>1，且 DNA 亲和纯化与免疫荧光证实 HOX 蛋白在原肠胚样体中实际表达（解释 ANANSE 预测与邻近标记的差异）。

2、ZEB2 在小鼠和人类体节发生中的功能

ZEB2 在未分化 mESCs 中不表达，96h 后原肠胚样体中上调；免疫荧光显示 120h 原肠胚样体中 ZEB2 与 SOX17-RFP+（内胚层）细胞无重叠，且 scRNA-seq 证实其在 Sox17 + 细胞中不表达。scRNA-seq 显示 ZEB2 缺失后，神经中胚层祖细胞（NMP）和体节中胚层比例减少，表面外胚层和喙侧神经外胚层比例增加；ZEB2 缺失细胞更多被归为 E7.75（22.48% vs 野生型 7.6%），E8.5 比例降低（16.78% vs 野生型 36.87%），提示发育阻滞。

构建 ZEB2 敲除（-/-）和杂合（+/-）人类 iPSC 系，诱导形成体节样结构（somitoids）：野生型 iPSC 形成多个体节样结构，ZEB2-/- iPSC 无法伸长，ZEB2+/- 呈中间表型（可伸长但无分节）；RT-qPCR 和 RNA-seq 证实，小鼠中 ZEB2 缺失上调的基因（CLDN7、KRT8 等）在人类中同样上调，下调基因（DMRT2）一致；人类 ZEB2-/- somitoids 中表面外胚层标志物富集，轴旁中胚层标志物下调，与小鼠结果一致，证实 ZEB2 在哺乳动物体节发生中的保守功能。

本研究通过多层蛋白质组学技术，特别是结合单细胞蛋白组，首次系统描绘了早期胚胎发育过程中的蛋白质表达动态和调控网络，揭示了 mRNA 与蛋白质表达的不一致性，强调了翻译水平和翻译后修饰调控在胚胎发育中的重要作用。