博士狗PCR秘籍大放送

1.提高退火温度——针对序列长、相似度高、GC%高的模板

引物是用来与模板互补结合后退火用来延伸的“引子”，延伸方向是5’到3’方向。

1.1 3’端一定是有G和C的，毕竟人家三个氢键，连接更紧密。5’连接不紧密问题不大，毕竟新碱基单体加入是从3’端进行的。

1.2 思想要解放！别太固守“退火温度要在55℃到65℃之间”这种老观念。本胖儿从35℃到85℃，全部做过！【变性98℃-退火60℃-延伸72℃】这个循环大部分都可以简化为【变性98℃-延伸72℃】。

1.3 我的建议是，大部分通过PCR扩增基因，可以尝试将引物设计的更长一些，将引物的退火温度设定在72℃，甚至更高，例如80℃以上！直接使用【变性98℃-延伸72℃】大约30个循环的程序来扩增。特别对于短重复序列多，GC含量高，片段长的情况，比较适宜采用这种办法！能够有效降低非特异扩增的发生概率。

 

2.体系中添加温和活性剂——针对非特异扩增多、GC%高的模板

2.1 PCR扩增体系中可以加入甜菜碱等添加剂，实现大幅降低非特异扩增比例。

甜菜碱的效果，我们用的最简单粗暴的方法来确定，直接Sanger测序，结果已用聚类软件进行分析。


 

HTT表示亨廷顿舞蹈症的致病三核苷酸重复片段。

0.8MBetaine表示反应体系中甜菜碱（Betaine）终浓度为0.8mol/L。

图中可以明显看出，随甜菜碱浓度的提高，扩增的准确性也逐渐提高，序列比对一致性显著增加。反应体系中甜菜碱在2M浓度以上时，几乎不存在非特异扩增。

 

 

2.2 甜菜碱作用原理

甜菜碱者，温和的离子型表面活性剂也。

易溶于水，具有较高渗透性，工业用途中常用作乳化剂，分散剂，性质稳定。

特异性扩增本底就强于非特异扩增，因此当甜菜碱均质的分散在PCR扩增体系中，给PCR扩增酶施以轻微的阻力时，特异性扩增与非特异扩增均受到抑制，但是由于非特异扩增本身能力较弱，所以受到的抑制效果就更大，就将非特异扩增会消耗的dNTP，离子和底物更多的提供给特异扩增，结果就是特异扩增在整个反应体系中所占比例显著上升。

 

 

2.3 还有啥可以代替甜菜碱？

有！甘油可以，浓度比甜菜碱略高；DMSO可以，浓度要比甜菜碱低不少。都属于温和的PCR扩增抑制剂。

还有！甲酰胺可以，浓度极低。不过！！！要注意，甲酰胺属于很强的DNA变性剂且对人体有神经毒性！所以强烈不建议使用。题外话……Sanger测序上机前最后一步，将PCR产物全部游离成为单链DNA的HiDi，就是溶解于Tris里面的甲酰胺。

 

 

3.PCR仪修改程序

3.1 缓慢降温

诚然，一般PCR反应，使用默认降温速度是可以满足需求的。然而，对于序列复杂，相似程度高，GC含量高，乃至三核苷酸串联重复多，此种类型的模板，本胖儿的建议是，将变性到退火这一段的降温速度，调整到5秒一度，乃至更慢。引物与模板的结合，是错配以恒定概率发生的事件，并且，结合与解离过程是同时发生的。温度降低的快，引物与模板结合的就快，解离的慢，因此发生的错配就容易被固定下来。温度降低的慢，引物与模板结合的慢，解离也在慢慢发生，引物与模板就能够“逐渐磨合”到一个空间位阻最低的相互结合的位置，就是最佳的匹配结合位置。

3.2 TouchDown大法

TouchDown又称为降落PCR。

原理是温度高时发生的特异性扩增多，温度低是发生的非特异扩增逐步增加。因此退火温度从高温到低温，随循环数逐步降低，最初循环中发生的主要是特异性扩增。后面随温度降低，即使非特异扩增与特异扩增以相同概率发生，但是由于起始循环中特异性扩增产物较多，后续扩增中，特异性扩增产物的积累速度也是远大于非特异扩增的。

 

例如一个PCR程序为30个循环，最初第一个循环中退火温度为65℃，每个循环降低0.5℃，那么程序后面循环的退火温度为64.5℃、64℃、63.5℃、…………52℃、51.5℃、51℃、50.5℃。

 

理想的扩增曲线如下图所示：

 

小技巧：退火温度设定范围建议是从（TM+5）℃ 逐步降温至（TM-5）℃。

 

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