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公司新闻/正文
组织特异性干扰怎么做——基于miRNA骨架设计shRNA
1966 人阅读发布时间：2020-08-24 15:39
RNAi介导的基因沉默已经被广泛应用于基因功能的研究。通常用于诱导持续的RNAi的手段，是用三型启动子持续表达shRNA。目前常用的三型启动子有U6和H1。这类启动子的优势在于他们可以控制shRNA的高水平表达，从而介导有效沉默。并且，通过三型启动子起始shRNA表达，构建序列较短，能够被轻易地插入病毒载体。但这类启动子也有一定的限制，首先就是缺少细胞和组织特异性；其次，高水平的shRNA表达有增加脱靶效应的风险，也可能导致细胞毒性1。
目前，越来越多的动物实验需要对某个组织进行特异性的基因表达调控。但受限于U6和H1缺乏组织特异性，我们需要一种新的方法来实现，比如利用二型启动子起始转录的miRNA结构，来表达shRNA。
miRNA的成熟过程与shRNA非常类似，不过多了一步在核内的加工过程。长度可达几kb的Pri-miRNA被Drosha加工形成70bp左右的Pre-miRNA。不同于shRNA二聚体完全互补的发卡结构，miRNA在被Dicer切割后形成的二聚体不完全互补（图1）。并且，大部分miRNA被Dicer切割产生的双链RNA往往只有一条链参与形成RISC。
图 1
miRNA调节基因表达主要有两种方式，一种是成熟的miRNA是和目的mRNA完全互补结合，然后切割降解mRNA；另外一种是成熟的miRNA和目的mRNA不完全互补，此时一般是结合在该转录本的3‘UTR区域，抑制转录（图2）。因此，除去常规的shRNA设计方式，还有一种shRNA设计方式是基于miRNA的结构进行设计。
图 2
具体的设计方案是将某个miRNA的5’ flanking region和3’flanking region及loop区域的序列保留，然后将miRNA成熟区域的序列替换成靶点序列，这里3’snese靶点序列往往会删除部分碱基使其与5’antisense不完全互补（图3）。
图 3
当然，并不是所有的miRNA采用这个设计方案都可以有效干扰目的基因，目前常用的miRNA骨架是miR-30和miR-155，而比如基于miR-27、let7a3和lin-4骨架的靶点均被报道无法有效地干扰目的基因2。基于miRNA骨架设计的shRNA同常规shRNA的一个很大区别在于，它可以采用二型启动子来起始转录，从而实现对某个组织进行特异性的基因下调。
一般而言，AAV干扰病毒需要先在体外进行筛选确认有效靶点，再进入在体的研究。但使用特异性启动子筛选的难点在于，它们仅在某一种特定的细胞类型中表达，很难在常用的工具细胞（如293T细胞）中开展筛选工作。为了解决这个难题，吉凯目前正在推出特异性启动子的AAV干扰靶点筛选服务，整个实验流程可以参考图4。
图 4
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【参考文献】
1. D. Grimm, K.L. Streetz. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/
short hairpin RNA pathways (2006). Nature. 441: 537–541.
2. N Manjunath , Haoquan Wu. Lentiviral Delivery of Short Hairpin RNAs (2009). Adv Drug Deliv Rev. 61(9):732-45.