非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的患病率正以惊人的速度上升，但尚未有任何批准用于治疗的药物。NASH药物开发的一个主要障碍是临床前研究难以转化为安全/有效的临床结果，迫切需要确定新的靶向途径。甘氨酸代谢失调已成为NASH的病因和治疗靶点。

 

2023年4月，西安交通大学刘恩岐、密西根大学陈育庆、张继锋及北京大学郑乐民等团队合作在Cell Metabolism（IF：31.373 ）上发表了题为“DT-109 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in nonhuman primates”的研究论文。本研究利用转录组学、蛋白质组学、代谢组学和宏基因组学的多组学技术揭示三肽DT-109 (Gly-Gly-Leu)能以剂量依赖性的方式减轻非灵长类动物的脂肪性肝炎和纤维化的作用机制，为DT-109作为非酒精性脂肪性肝炎药物的临床试验成功再添信心。



 

研究结果

1. 三肽DT-109以剂量依赖性的方式缓解小鼠非酒精性脂肪性肝炎

研究者分别用NASH饮食及标准饮食喂养小鼠12周。随后，对NASH组小鼠，在NASH饮食喂食的基础上，给小鼠口服不同剂量的DT-109（0、15、45、150和450mg/kg）。标准饮食组小鼠则在喂食标准饮食的基础上口服H₂O，作为对照。在第24周，安死小鼠，并进行肝组织形态、血清生化指标等检测。结果显示，（1）NASH组小鼠的体重显著高于对照组；（2）DT-109以一种剂量依赖性的方式降低小鼠肝重量及肝与体重比例，且在450mg/kg剂量时有最显著的效果。此外，DT-109也以一种剂量依赖性的方式降低血浆中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及碱性磷酸酶(ALP)，在450mg/kg剂量时有最显著的效果。同时，肝的形态学和生化检测也显示，DT-109显著降低了NASH饮食对肝的伤害。总体，以上结果表明，DT-109以剂量依赖性的方式缓解小鼠非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化，在450mg/kg剂量时有最显著的效果。



 

2. 构建一个模拟人类NASH的非灵长类动物模型

为了提高临床实验的转化成功率，研究者构建了非人灵长类（食蟹猴）NASH疾病模型。研究者从超过1000只猴子中挑选出了20只易诱发NASH的猴子，并喂食NASH饮食。10个月后，发现猴子的肥胖情况、肝损伤、高血糖和高血脂情况都比基线时显著增高。肝活检样本的组织学检测也显示存在明显升高的肝脂肪变性、肝小叶炎症、NAFLD活动度评分（NAS）和纤维化评分值。

 

随后，研究者对喂食NASH饮食10个月前后的肝组织进行转录组RNA测序，以评估非人灵长类模型和人NASH之间的相似性。研究者比较了猴子中喂食NASH饮食比喂食标准食物的前100差异基因与NASH病人比无NASH病人的前100差异基因，发现猴子模型和人NASH有很显著的转录相似性。通路富集分析也显示，与NASH相关的通路相似，包括上调的通路：细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和细胞外基质受体相互作用；下调的通路：甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、色氨酸代谢。此外，通过比较另外一个206的人NASH队列，研究者发现一些已知的通过诱导脂肪酸（FA）降解在NASH中起保护作用的基因（如PPARA）在人NASH患者和猴子模型中显著下调，且与肝脂肪变性负向相关。相反，一些通过促炎和促纤维化信号来促进NASH进展的基因（如NLRP3和TGFB1）在人NASH患者和猴子模型中显著上调，且与肝脂肪变性正向相关。综合以上，研究者建立的非人灵长类（食蟹猴）NASH模型与人类疾病近似。


 

3. DT-109逆转非灵长类NASH模型的肝脂肪变性、组织炎症和纤维化进展

将喂食NASH饮食10个月后的猴子随机分为两组，在保持NASH饮食的基础上，分别喂食DT-109（实验组）或者H₂O（对照组） 5个月。5个月后，检测发现实验组和对照组在体重、腹围、腰围上无显著差异，在血糖、血脂上也无显著差异。而在服用DT-109后，血液中的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶(ALT)显著降低。同时，对照组的肝组织呈现淡黄色，而服用DT-109的肝则减弱了这一变化。组织学检测发现，DT-109的猴子肝脏有更低的肝脂肪变性、肝细胞气球样变性、总NAFLD活动度评分（NAS）和纤维化评分值。未服用DT-109组（对照组）则有显著更高的肝小叶炎症和肝纤维化。总体，这些发现表明，DT-109可以通过逆转肝脂肪变性和抑制组织炎症及纤维化进展而减轻非灵长类NASH模型的症状。


 

4. 转录组学和蛋白质组学揭示DT-109诱导肝脂肪酸降解和抑制促炎/纤维化反应

接下来，研究者通过高通量多组学的技术揭示DT-109减轻NASH的分子机制。首先，研究者对前述喂食5个月DT-109（实验组）或H₂O（对照组）的猴子肝组织进行了转录组RNA测序。PCA分析显示实验组和对照组有明显区分。实验组比对照组共得到391个上调基因和575个下调基因。前100差异基因中调控促炎和免疫应答的基因以及调控纤维生成和ECM（细胞外基质）重塑的关键基因下调，而一个能量和脂肪酸代谢的主调节因子PPARGC1A和一些调控脂肪酸和胆固醇代谢的基因（如CYP1A2）则在服用DT-109后显著上调。通路富集分析显示，服用DT-109后引起了与NASH相反的响应。

 

随后，研究者通过蛋白质组学技术检测转录层面上的改变是否和蛋白质层面一致。转录组和蛋白质组的通路富集结果比较发现两者有很高的相似性，比如脂肪酸降解、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢是DT-109处理后前几个上调的通路，而趋化因子信号、粘着斑和ECM受体相互作用则是前几个下调的通路。组织学和生化检测也进一步验证了上述发现。总体，通过转录组学和蛋白质组学以及组织学和生化验证都表明，在非人灵长类NASH模型中，服用DT-109可诱导脂肪酸降解、抑制促炎和纤维化反应。


 

5.代谢组学揭示DT-109抑制胆汁酸（BA）代谢

研究者同时对实验组和对照组的猴子血清进行了非靶向代谢组学检测，以揭示背后的代谢机制。PCA和OPLS-DA分析显示，服用DT-109后，代谢组特征发生明显变化。通路分析显示，最显著富集的通路是胆汁酸（BA）生物合成途径。在服用DT-109后，全体胆汁酸都下调，其中最显著下调的是次级胆汁酸和石胆酸（LCA）。靶向胆汁酸的代谢组学检测也证实了这一发现。总体，非靶向和靶向代谢组学显示服用DT-109后能降低NASH的循环胆汁酸。

6. DT-109改变与石胆酸代谢相关的肠道微生物

为了探索DT-109调控石胆酸（LCA）代谢的机制，研究者继续进行了多组学检测。

 

（1）实验组和对照组猴子的肝组织的非靶代谢组学的PCA和OPLS-DA分析显示，服用DT-109后的猴子呈现完全不一样的代谢组特征。通路富集分析也显示了初级胆汁酸生物合成途径的富集。胆汁酸靶向代谢组学检测则未发现总胆汁酸、初级和次级胆汁酸以及LCA在肝组织中的表达差异。因此，研究者对粪便样本也进行了非靶向代谢组学检测，PCA和OPLS-DA以及热图分析均表明实验组和对照组有显著差异。LCA在粪便样本中有很高的浓度，并且在服用DT-109后显著下调。

 

（2）考虑到肠道微生物在前体CDCA（鹅去氧胆酸）通过7α-脱羟基作用生成石胆酸（LCA）中的关键作用，研究者使用16s rRNA测序（宏基因组）对实验组和对照组猴子的粪便中的微生物组成进行了检测。研究者在属的水平上找到了一些实验组和对照组有差异的微生物。最终发现其中的大肠埃氏菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)被报道在人NAFLD(非酒精性脂肪肝病)和肝纤维化中有较高水平，且与血清AST、NAS和纤维化评分以及肝LCA有最显著的正相关。相反，已知的一种抗炎和在小鼠中可以降低肝脂肪变性的Faecalibacterium prausnitzii与血清AST、NAS和纤维化评分以及肝LCA有最显著的负相关。

 

以上这些发现表明，服用DT-109改变了非人灵长类NASH模型中与LCA代谢和NASH(非酒精性脂肪性肝炎)相关的肠道微生物。


 

7. DT-109抑制微生物产生与人的NAFLD风险独立相关的石胆酸

接下来，研究者探究DT-109是否是通过调节肠道微生物来抑制LCA（石胆酸）生成。首先，研究者通过qPCR确认，在服用DT-109的猴子粪便中Faecalibacterium prausnitzii显著上调，Escherichia Shigella显著下调。随后研究者确认Faecalibacterium prausnitzii能显著降低LCA的产生，并且在众多生产酸盐的微生物中，服用DT-109仅能特异性提高Faecalibacterium prausnitzii的水平。最后，研究者通过靶向LCA的代谢组学检测了NAFLD（非酒精性脂肪性肝病）患者和健康人血液中LCA的水平。结果显示，LCA在NAFLD患者中有更高的含量。重要的是，经过矫正年龄和性别后，循环LCA与NAFLD风险正相关。矫正甘油三酯、空腹血糖和高密度脂蛋白胆固醇后，上升的LCA仍然是NAFLD的独立预测因子。这些发现表明，DT-109通过调节肠道微生物以加强Faecalibacterium prausnitzii，进而抑制一种在NAFLD中上调且与NAFLD风险独立相关的肝毒性胆汁酸LCA（石胆酸）的生成。

 

研究总结

本研究报告了三肽DT-109（Gly-Gly-Leu）在小鼠中以剂量依赖性地方式减轻脂肪性肝炎和纤维化。为了提高成功转化为临床应用药物的概率，研究者开发了一个非人类灵长类动物（食蟹猴）的NASH模型，该模型在组织学和转录组水平上与人类NASH类似。结合转录组学、蛋白质组学、代谢组学和宏基因组学的多组学方法，研究者发现DT-109可以逆转非人灵长类动物的肝脏脂肪变性并防止纤维化进展，其作用机制不仅是通过诱导脂肪酸降解和谷胱甘肽的形成，而且还通过调节肠道的微生物的胆汁酸代谢。总体，本研究构建了一个高度可转化的NASH模型，并强调了对DT-109进行临床评估的必要性。

 

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