骨骼系统作为人体八大系统之一，在人体中发挥着重要的作用。但是因为一些客观的因素比如交通的进步、生活方式以及居住环境的改变，导致和骨骼系统相关性的疾病的发生率也越来越高。所以说现在关于骨骼细胞的研究也越来越深入。骨骼的成分之一是矿物质化的骨骼组织，其内部是坚硬的蜂巢状立体结构；其他组织还包括了骨髓、骨膜、神经、血管和软骨。

同时关于基因治疗的研究也如火如荼，在基因治疗方面AAV就是最常用的基因递送的载体。对于做基础研究的老师们或者是临床做科研的老师们而言，如何用AAV靶向骨骼系统实现目的细胞的调控，是老师们最关心的点。针对骨骼系统的AAV靶向策略会分成上下两期进行讲解。本期主要介绍针对骨骼细胞AAV的血清型以及注射方式。

 

血清型

 

骨骼系统里骨组织包含的细胞主要有四种：骨祖细胞、成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞。在Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis这篇文献^[1]中，作者在体外检测了不同血清型AAV对成骨细胞（COB），骨髓间充质来源的成骨前体细胞（BM-OCP）和软骨前体细胞系（ATDC5）的感染效率，结果表明Raav1，4，5，6，7，9，rh10和rh39等八种血清型的AAV在体外成功感染成骨细胞。在体内作者利用关节腔注射的方式检测上述血清型对于体内的感染效率。结果表明只有rAAV9可以成功感染松质骨和皮质骨处的骨骼细胞，包括骨细胞、成骨细胞和破骨细胞等。

 

注射方式

  

对于骨骼系统的AAV靶向策略来说，骨骼系统的结构分为三种注射方式。一种是针对骨骼系统特异性的注射方式：骨关节腔注射，另一种是常规的静脉注射还有一种是针对骨髓的骨内注射。

骨关节腔内注射：

上述的文献中，作者采用了膝关节注射AAV到两个月大的小鼠的膝关节内。注射的剂量都是1E11gc，滴度是在1-6E12gc/ml的范围内。

除此之外，Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis这篇文献^[2]是使用了吉凯产品的客户文献，作者在这里采用的也是采用的关节腔内注射的方式，滴度是1E11vg/ml，每个关节5μl的注射量，感染8周龄的小鼠，在感染之后的12和24周收集膝关节组织。在ACLT手术24周之后，作者通过HE、Masson检测Runx1对于骨关节晚期生长板的影响。结果表明，Runx1过表达会保留生长软板的厚度。

骨内注射：

在Adeno associated viral-mediated intraosseous labeling of bone marrow derived cells for CNS tracking这篇文献^[3]中，作者采用了骨内注射的方式，滴度为4.5E13vg/ml，注射体积为5μl，感染四个月的小鼠。对于骨内注射的具体的操作步骤如下：

1. 用异氟烷对小鼠进行麻醉，双膝屈曲，膝后各有一个支撑物。剃除关节周围的毛发，用 70% 的酒精和碘酒清洁关节区域。

2. 用1毫升注射器，将25号针头插入股骨内间隙，在胫骨和股骨关节之间的股骨顶部髁之间轻轻扭转并施压，将25号的针头和针帽留在原处，轻轻取出 1 毫升注射器。

3. 将带有32G针头的汉密尔顿注射器插入塑料盖开口。32G骨髓针在距针尖3.5厘米处做标记，以指示穿刺长度。

4. 将病毒缓慢注入股骨柄。然后慢慢取出以限制回流。轻轻拔出针头，观察小鼠让其恢复。

静脉注射：

 

在Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis这篇文献^[1]中，作者除了采用关节腔注射之外，还采用了静脉注射的方式。如上图所示，作者为了测试AAV9在体内系统递送时靶向骨组织的能力，将rAAV9-EGFP注射到2个月大的小鼠体内，并通过EGFP的表达评估 rAAV9 在组织中的分布。在这里作者采用的就是静脉注射的方式，剂量是4E11gc，注射两周之后评估绿色荧光的分布能力。结果表明，EGFP主要在骨皮质和骨小梁中的骨内膜成骨细胞和骨细胞中表达，而在韧带、关节软骨和骨韧带中则没有表达。这些结果表明，系统递送的 rAAV9 向量靶向骨内的成骨细胞。

综上，建议各位老师针对体内的骨骼系统的AAV感染策略上采用AAV9+骨关节腔注射的方式搭配。针对骨骼系统里面不同的细胞具体采用的特异性启动子的类型我们将在下期进行详细的介绍，有相关需要的老师请持续关注我们。

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参考文献…

1. Yang, Y.-S., et al., Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis. Nature Communications, 2019. 10(1).

2. Zhou, C., et al., Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis. Bone Research, 2021. 9(1).

3. Selenica, M.-L.B., et al., Adeno associated viral-mediated intraosseous labeling of bone marrow derived cells for CNS tracking. Journal of Immunological Methods, 2016. 432: p. 51-56.