CRISPR Cas9文库筛选测序——功能基因发现利器

CRISPR-Cas9系统最初是在细菌中发现的一种免疫机制，用于抵御外来的病毒和质粒。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一系列重复的DNA序列，它们之间由独特的间隔序列分隔。这些间隔序列是细菌在以前遭受病毒侵袭时获得的病毒DNA片段。Cas9（CRISPR-associated protein 9）是一种核酸酶，能够在特定的DNA序列上切割双链DNA。

 CRISPR-Cas9系统工作原理

非单细胞Crispr-Cas9文库筛选测序：利用Crispr-Cas9技术建立与某类功能相关的基因突变亚库或者全基因组的突变体库，利用慢病毒载体在细胞中大规模导入构建好的sgRNA亚库或者全库，收集已经成功导入sgRNA亚库或者全库的细胞，提取全基因组DNA，扩增出sgRNA进行测序，能够同时靶向成百上千个基因，实现高通量的功能基因筛选。

单细胞Crispr-Cas9文库筛选测序：基于10x Genomics Chromium平台的单细胞CRISPR筛选，它基于scRNA-seq测序，在scRNA-seq期间捕获和扩增sgRNAs以及细胞转录组，以汇集的形式同时读出单细胞的CRISPR sgRNA遗传扰动信息和转录组信息；单细胞Crispr-Cas9筛选能够在单细胞水平评估多个基因的扰动效应，以及在整个转录组中的每个sgRNA，是一种高通量、低成本、高灵敏度的单细胞水平CRISPR筛选。

单细胞CRISPR与传统bulk RNA方法的对比

研究目的：探究宿主与病毒之间的基因依赖关系并找到 COVID-19 的潜在治疗靶点。

技术方法：全基因组文库病毒（KO文库）、全基因组Crispr-Cas9功能筛选（锁定30个目标基因），单细胞（RNA+sgRNA）测序。

研究结果：在人肺上皮细胞中进行了全基因组KO病毒文库感染，然后进行非单细胞的Crispr-Cas9文库筛选测序，确定了SARS-CoV-2感染所需的基因和途径，包括液泡ATP酶质子泵、Retromer和Commander复合物。利用单细胞Crispr-Cas9测序对锁定的30个基因的亚文库进行测序，发现除了阻断ACE2受体外，胆固醇生物合成途径的上调是抵抗病毒的共同机制。

研究思路：